葡萄溃疡病菌巢式PCR高效检测体系的建立

葡萄溃疡病（grape canker）在世界葡萄种植区普遍发生,可引起葡萄的顶梢枯死、枝干溃疡、果实腐烂等症状,严重时可导致植株整株死亡,给葡萄生产造成严重危害[1]。已知葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae中的17个种可引起葡萄溃疡病[1]。     

核桃枝枯病小新壳梭孢巢式PCR检测方法的建立

近年来,小新壳梭孢Neofusicoccum parvum导致的核桃枝枯病屡有报道,该病防治困难,发病率高,是核桃的一种灾难性病害。为建立N.parvum的快速、灵敏的分子检测体系,根据N.parvum的几丁质合酶1基因(CHS1)及其前后100bp序列,分别设计了两对特异性引物CT-WK3-S/CT-WK3-A和CT-N-S/CT-N-A,建立了N.parvum的巢式PCR检测方法。结果表明,建立的体系可以从不同来源的5个N.parvum菌株中特异性地扩增出97bp的目的条带,灵敏度达30fg/μL,是常规PCR的10倍,而从其近缘种葡萄座腔菌属Botryosphaeriasp.的病原菌及其他供试菌株均未扩增出任何条带。以感染N.parvum的核桃组织总DNA为模板进行检测,可以在发病早期检测出N.parvum的存在。本研究建立的巢式PCR体系可以为核桃枝枯病的田间检测提供思路。     

双重PCR检测马铃薯晚疫病菌和青枯病菌方法的建立及应用

 利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增马铃薯晚疫病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列比较,设计了1对马铃薯晚疫病菌的特异引物INF1/INF2,并对15种不同真菌、细菌和7种疫霉属和腐霉属卵菌基因组DNA进行PCR扩增,结果只有不同来源的马铃薯晚疫病菌株可获得324 bp的特异带。将引物INF1/INF2与卵菌通用引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达30 fg。运用设计的引物与马铃薯青枯病菌特异引物结合建立了双重PCR体系,能从马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌总基因组DNA以及人工接种和自然发病的马铃薯植株中分别或同时扩增到324 bp和281 bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌的快速可靠检测。     

菠萝泛菌与水稻白叶枯病菌双重PCR检测方法的建立与应用

近年来水稻发生了一种由菠萝泛菌Pantoea ananatis引起的新型细菌病害,其发生时期与白叶枯病相近,病症与白叶枯病类似。为了实现该病害与白叶枯病的快速检测,本研究基于泛菌属看家基因acnA,通过序列比对,设计了22对特异性引物,分别与已知的白叶枯病菌检测引物XOO80进行配对并筛选,建立了一种双重PCR检测方法,可从菠萝泛菌和白叶枯病菌中分别扩增出910 bp和162 bp的特异性条带,而其他10种非目标细菌均未有扩增条带,25μL体系中可稳定地从至少1 pg/μL的基因组DNA模板中扩增出特异性条带。本研究建立的菠萝泛菌与水稻白叶枯病菌双重PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度,为水稻细菌病害病原鉴定及防治提供了技术支撑。     

番石榴焦腐病菌的ITS分析及PCR检测

番石榴焦腐病是台湾入境大陆水果的重要植物病害,由葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina引起.为建立该病原菌快速、灵敏的检测技术,比较分析了葡萄座腔菌和葡萄座腔菌属其它种的ITS序列,在此基础上设计了1对检测番石榴焦腐病菌的特异性引物BF1/BR1,利用此引物从葡萄座腔菌中特异性扩增出287bp条带,而其余参试的菌株未能获得扩增条带.将真菌通用引物ITS1/ITS4和BF1/BR1进行巢式PCR扩增后,检测灵敏度提高1 000倍,可检测到葡萄座腔菌1pg的基因组DNA.结合快速碱裂解法提取发病组织的DNA,采用该PCR检测技术可从自然感染焦腐病果实中检测到葡萄座腔菌.     

4种常用杀菌剂对江苏省番茄枯萎病菌的毒力

采用菌丝生长速率法测定了4种杀菌剂对36株番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的毒力。结果表明,不同杀菌剂对番茄枯萎病菌的毒力水平有显著差异,25%氰烯菌酯悬浮剂和50%多菌灵可湿性粉剂对菌落生长的抑制毒力最强,EC50分别为1.65μg/mL和2.91μg/mL;3%中生菌素可湿性粉剂的毒力次之,EC50为12.56μg/mL;75%百菌清可湿性粉剂的毒力最小。不同地区的番茄枯萎病菌对4种杀菌剂的敏感性存在明显的差异,铜山地区的菌株除了对多菌灵、氰烯菌酯有较高的敏感性外,对其他2种杀菌剂都呈不同程度耐药性;沭阳地区的菌株对4种杀菌剂的敏感性均很强;姜堰地区的菌株对百菌清有较弱的敏感性,对其他3种杀菌剂的敏感性均较强。本研究为化学防治番茄枯萎病、科学合理用药提供参考依据。     

江西省樟树溃疡病病原鉴定与室内药剂筛选

【目的】樟树溃疡病主要危害幼龄樟树枝干部,严重影响樟树的生长。明确江西省樟树溃疡病的病原菌种类及评估5种农药对病原菌的药效尤为必要。【方法】本研究采集了江西省3个地区典型的樟树枝干溃疡病标本,采用组织分离法获得分离物,通过致病性试验明确病原菌,采用形态与分子生物技术鉴定病原菌种类,进一步测定了5种杀菌剂对病原菌的毒力。【结果】江西省樟树溃疡病病原菌为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和新壳梭孢（Neofusicoccum parvum）;最适生长温度为20～30℃,超过35℃生长受到抑制;杀菌剂毒力试验结果表明,98%多菌灵可湿性粉剂对两种病原菌的菌落抑制效果较好,EC50分别为0.01和0.015 mg/L,其次为95%己唑醇。【结论】研究结果可为江西樟树溃疡病病原菌种类分析提供技术支撑,并为综合防治策略提供参考。     

葡萄霜霉病菌PCR检测方法的建立与应用

通过对已测序和已报道的葡萄霜霉病菌［Plasmopara viticola (Berk et Curtis) Ber.et de Toni］细胞色素c氧化酶亚型2（cytochrome c oxidase Ⅱ,cox2）的基因序列进行同源性比对分析,设计合成了一对用于P.viticola的检测引物F Pv/R Pv。利用该引物对包括P.viticola在内的30种常见植物病原真菌（包括15种Plasmopara属真菌、8种葡萄常见致病菌）的基因组DNA进行了PCR扩增,验证引物F Pv/R Pv的特异性,结果表明：该引物特异性强,仅P.viticola基因组DNA作为模板的PCR扩增产物呈现一条600 bp左右的特异性条带,其他参照菌株及阴性对照均无任何条带;灵敏度验证结果表明,该检测法可以检测出3.3 pg/μL 水平的P.viticola基因组DNA;应用该方法对来自全国不同葡萄产区的不同品种的78份葡萄霜霉病菌进行了检测,结果表明,该检测法适用范围广,且检测准确率达100%。     

引起玉米穗腐病的两种镰孢菌双重PCR快速检测体系的建立

禾谷镰孢(Fusarium graminearum)和拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是引起玉米穗腐病的两种主要病原菌。为了建立这两种病原菌的快速和定量检测体系,本研究分别设计了针对F.graminearum和F.verticillioides的基因特异性引物,建立了双重PCR反应体系,并从DNA浓度、引物浓度和退火温度3个方面对反应体系进行了优化。结果表明,退火温度为54℃和58℃时扩增效果较好,DNA模版的检测灵敏度可以达到6.25 ng·μL~(-1);F.graminearum和F.verticillioides引物最佳终浓度配比为0.2μmol·L~(-1)/0.4μmol·L~(-1)。本研究建立的双重PCR对同时鉴别引起玉米穗腐病的两种主要镰孢菌提供了准确、快速、灵敏的检验检疫技术。     

利用双重PCR技术快速检测水稻细菌性谷枯病菌

根据水稻细菌性谷枯病ITS和gyrB基因,设计两对特异性PCR检测引物,建立了水稻细菌性谷枯病菌的双重PCR检测方法。用该方法对水稻细菌性谷枯病菌和其它植物源性细菌进行双重PCR扩增及灵敏度测试,并对采自不同地区的水稻样本进行水稻细菌性谷枯病菌的检测。结果显示,双重PCR方法能特异性地检测出8株水稻细菌性谷枯病菌,可从含水稻细菌性谷枯病菌浓度为102cfu/mL的菌液中检测出该病菌;采用该方法对我国不同地区的水稻材料进行检测,并未发现水稻细菌性谷枯病菌。     

苹果轮纹病菌LAMP快速检测方法的建立

为建立快捷、灵敏检测苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea的环介导等温扩增(loop-medi‐ated isothermal amplification,LAMP)检测方法,以其内转录间隔区ITS序列为靶标,设计6条LAMP引物,对其特异性进行检测,优化反应条件并建立苹果轮纹病菌的LAMP检测方法。引物特异性检测结果表明,2株苹果轮纹病菌反应结果呈绿色为阳性,而其它3株对照菌株反应结果呈橙色为阴性,表明了LAMP检测引物的高特异性。优化后的LAMP最佳反应条件:温度65℃、扩增时间60 min、FIP/BIP、F3/B3、LF/LB引物终浓度分别为1.0、0.25、0.5μmol/L。LAMP检测方法对苹果轮纹病菌DNA的检测灵敏度达到了100 ag/μL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。田间疑似轮纹病组织检测结果发现LAMP方法对苹果轮纹病菌的检出率高达68%,而传统分离鉴定方法的检出率仅为24%。表明所建立的苹果轮纹病菌LAMP快速检测方法简便快捷、特异性好、灵敏度高,尤其适用于基层植保机构对于苹果轮纹病菌的田间快速检测。     

番茄煤污假尾孢叶斑病菌实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

为快速、准确地对番茄煤污假尾孢Pseudocercospora fuligena进行检测与定量分析,基于其Avr4基因设计特异性引物JWB-9F/JWB-7R,建立实时荧光定量PCR检测技术,分析该检测技术的特异性和灵敏度,并利用采集自重庆市、河北省和广西壮族自治区的14份材料对该检测技术的应用效果进行验证。结果表明,引物JWB-9F/JWB-7R仅可从番茄煤污假尾孢基因组DNA中扩增出232 bp的目的片段,特异性良好;实时荧光定量PCR检测技术的灵敏度为67.09 copies/μL,是普通PCR检测技术的1 000倍。且该实时荧光定量PCR检测技术可以实现未显症样本中番茄煤污假尾孢的定量检测,检测限为6.02×10~2copies/μL,实际应用效果较好。表明所建立的实时荧光定量PCR检测技术可用于番茄煤污假尾孢叶斑病的早期诊断和预测预报。     

桑椹菌核病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

为及时高效地鉴别桑椹菌核病的病原菌桑实杯盘菌Ciboria shiraiana和肉阜状杯盘菌C. carunculoides,根据RPB2基因序列设计引物并验证其特异性,建立这2种病原菌的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q PCR)检测体系,运用该体系对抗、感果桑品种不同时间点芽(果)内的2种病原菌进行检测。结果表明,设计的2对引物特异性强,qPCR检测灵敏度均为10^-4ng/μL,均为常规PCR灵敏度的10~5倍,建立的桑实杯盘菌和肉阜状杯盘菌qPCR标准曲线的扩增效率分别为104.89%和95.30%。利用所建方法成功从采集的果桑样品中检测出病原菌主要为肉阜状杯盘菌,且感病品种中肉阜状杯盘菌的含量随着时间不断增加,在将要显症时激增。表明所建qPCR体系适用于桑椹菌核病早期无症状芽(果)的检测,可通过监测其病原菌类型和含量为该病害的预测预报及早期防治提供依据。     

长岭发垫刃线虫(Trichotylenchus changlingensis)双重PCR检测方法研究

正长岭发垫刃线虫(Trichotylenchus changlingensis)是一种迁移性植物外寄生线虫,该线虫于2011年首次在我国吉林省长岭县发现,并根据其形态特征及最新分类系统将其归为发垫刃属[1,2]。该线虫能引起玉米叶片黄化,植株矮化,茎基部开裂,茎节缩短等症状,该病发生率普遍在21%～67%,给玉米生产造成了严重影响[3]。     

三重PCR检测茄子青枯病菌、黄萎病菌和白绢病菌

为快速、准确对田间茄子发病植株和土壤中3种土传病害的病原菌青枯病菌Ralstonia solanacearum、黄萎病菌Verticillium dahliae和白绢病菌Sclerotium rolfsii进行检测,筛选这3种病菌的特异性引物,建立这3种病菌的三重PCR检测体系,对其退火温度、引物浓度、10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP和Taq DNA聚合酶进行优化,对优化后体系的特异性和灵敏度进行检测,并利用优化体系对田间采集的病害样品和土壤样品进行检测。结果表明,在优化后的50μL三重PCR检测体系中,RS-1-F/RS-3-R、dllz1/dllz2和SRITSF/SRITSR引物的最佳浓度分别为0.16、0.16和0.28μmol/L,10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP和Taq DNA聚合酶体积分别为6、5和1μL,检测体系的最佳退火温度为54℃。按照优化后的反应条件能分别扩增出青枯病菌、黄萎病菌和白绢病菌3种病菌的特异条带,分别为716、350和500 bp,其他对照病菌无条带。该体系对病菌DNA检测灵敏度达到0.1 ng/μL。该...     

麦冬主要病害病原菌巢式多重PCR检测方法的建立

为准确快速地诊断浙江省慈溪市麦冬常见真菌病害——炭疽病和黑斑病,基于巢式多重PCR技术,针对核糖体内转录间隔区(ITS)序列分别设计特异性引物,并优化巢式多重PCR反应条件,建立可同时快速准确检测炭疽病病原菌山麦冬炭疽菌Colletotrichum liriopes和黑斑病病原菌互隔交链孢菌Alternaria alternata的方法。结果表明,建立的巢式多重PCR检测体系特异性好,同时检测2种病原菌的灵敏度高达100 pg DNA/μL,对10个田间病样进行检测,有5个病样检测到2种病原菌,3个病样检测到其中1种病原菌,2个样品未检测到目标病原菌,验证了该体系的可行性与准确性。表明所建立的巢氏多重PCR技术可用于快速准确检测麦冬2种主要病害的病原菌。     

实时荧光定量PCR法检测十字花科细菌性黑斑病菌

为有效防控我国的检疫性有害生物十字花科细菌性黑斑病菌Pseudomonas syringae pv.maculicola在国内的传播与蔓延,通过设计1对特异性引物3539,利用132株靶标和非靶标菌为模板进行PCR扩增,建立了实时荧光定量PCR法,并进行了模拟种子带菌试验。结果显示,引物3539为只针对十字花科细菌性黑斑病菌扩增出的特异性产物;在模拟种子带菌检测中,常规PCR对菌悬液的检测限为10~5CFU/m L,实时荧光定量PCR的检测限为10~3CFU/m L,其中10~8CFU/m L菌液的Ct值最低,为22.90,10~3CFU/m L菌液的Ct值最高,为35.73,且不同浓度菌液间的Ct值均有显著差异;不同带菌率模拟种子的检测结果表明,常规PCR和实时荧光定量PCR能检测到的带菌率分别为0.5%和0.1%。研究表明,实时荧光定量PCR法不仅可用于病种的检测,也可用于病害的早期诊断。     

猕猴桃软腐病病原菌的分离鉴定及其防治药剂筛选

为明确引起猕猴桃软腐病病原菌的种类并筛选有效防治药剂,2015年10月于安徽省金寨县猕猴桃基地采集具有典型软腐病症状的40个果实病样,对分离所得病原菌进行致病性测定、形态学和分子生物学鉴定,同时测定了10种常用药剂对病原菌的抑菌效果。结果显示,结合分离物的形态学特征及rDNA-ITS、β-tubulin和EF-1α基因序列分析结果,确定10株经致病性验证的菌株均为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。药剂筛选结果显示,多菌灵对该病原菌菌丝生长抑制效果最好,抑制率高达91.97%,其次是95%三唑醇1 600倍液,抑制率为81.72%,其余药剂对菌丝生长的抑制率均低于80.00%;多粘芽胞杆菌对该病原菌孢子萌发抑制效果最好,未见该病菌孢子萌发,70%代森锰锌可湿性粉剂1 000倍液、12.5%烯唑醇可湿性粉剂3 000倍夜、10%混合脂肪酸水剂100倍液、95%三唑醇原药1 600倍液和1.8%辛菌胺醋酸盐水剂180倍液对病原菌孢子萌发的抑制率均大于81.00%。表明多菌灵和多粘芽胞杆菌是防治葡萄座腔菌菌丝生长和孢子萌发的最佳药剂。