禾谷丝核菌在土壤中生长的研究

 1980年从小麦发病的茎秆上分离到病菌,并对小麦等多种植物进行了致病力测定。     

禾谷丝核菌基因组SSR标记的开发及评价

群体遗传学研究对于了解病原菌的流行、变异及进化规律具有重要意义。但是到目前为止,对小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传结构的了解并不深入,缺乏有效的SSR标记是主要原因。本研究根据禾谷丝核菌全基因组序列进行了微卫星位点搜索并设计SSR引物,通过电泳筛选和测序验证,最终筛选出12个多态性较好且稳定可靠的SSR标记。利用这些标记对收集自我国安徽、江苏、河南三省的23个禾谷丝核菌菌株进行了多态性分析,结果发现禾谷丝核菌基因组中长片段微卫星位点较少。12对引物扩增出的等位基因数平均为6.1个,期望杂合度平均为0.651,观测杂合度平均为0.508,表明这些标记具有较高的多态性,能够满足禾谷丝核菌群体遗传学研究需要。本研究为进一步进行禾谷丝核菌的多样性、群体遗传结构分析及进化学研究提供了有效工具。     

立枯丝核菌侵染玉米的研究

 用获自水稻及玉米的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Khn) AG-11A接种玉米发生典型纹枯症状,其致病力显著强于AG-4。玉米拔节期,上位叶鞘抗性较强,抽雄及抽丝期抗性减弱,下位叶鞘无论在拔节期或抽雄、抽丝期,均较上位叶鞘感病。接种玉米后8小时,形成侵染垫及附着胞,从这些结构上形成侵入钉侵入,AG-4侵染上位叶鞘时,常以菌丝直接穿透表皮或从气孔侵入。在去掉菌体的叶鞘表面,发现有周边光滑或稍破损的侵入孔。接种后12小时,在叶鞘细胞中发现菌丝,它们在穿过细胞壁进入邻近细胞时,明显变细。接种后16小时,新生出的菌丝从气孔成丛出现。     

禾谷丝核菌对井冈霉素的抗性风险预测

采用菌丝生长速率法,测定了4个麦区的5个禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis菌株对井冈霉素的抗药性;在含井冈霉素的PDA平板培养基上对禾谷丝核菌进行继代培养,以诱导抗药性菌系;测定了抗性菌系对其他杀菌剂的交互抗性,并比较了抗性和敏感菌系对渗透压的敏感性及药剂处理后两种菌系培养液内还原糖和可溶性蛋白的含量差异。结果表明,田间禾谷丝核菌菌株对井冈霉素分别产生了7.26、7.75、10.46、14.92和23.31倍的抗性。室内继代培养36代,禾谷丝核菌对井冈霉素的抗性达49.24倍,形成了抗井冈霉素菌系。抗井冈霉素菌系对 口 恶 醚唑、福美双、三唑酮、丙环唑、戊唑醇和咯菌腈分别产生了48.58、21.78、17.62、10.95、2.55和1.78倍的交互抗性。抗性菌系在较低和较高渗透压下其生长抑制率均大于敏感菌系,用井冈霉素处理抗性和敏感菌系后,其体内的电解质都严重外渗,且抗性菌系在10 h 内的外渗量明显大于敏感菌系。     

禾谷丝核菌拮抗细菌的鉴定及其拮抗产物分析

 小麦纹枯病是长江中下游麦区重要的土传病害。明确小麦根际拮抗细菌种类和拮抗机理对小麦纹枯病生物防治具有重要意义。从江苏省姜堰市小麦根际分离到拮抗细菌A6、A12、B37、B40、B41和B42。通过生理生化测定和16SrDNA同源序列比对分析,这些菌株都为荧光假单胞杆菌。在温室条件下进行种子处理,这些菌株对小麦纹枯菌都有一定的控制作用,其中菌株A6、B41和B42的控病作用明显,菌株B42对小麦纹枯病的控制效果最好,温室防效达71.67%。基因检测和次生代谢物分析的结果表明:6个菌株都不产生2,4-二乙酰基间苯三酚和吩嗪,菌株A12、B37和B42含有与吡咯菌素合成相关的基因PrnD,在菌株B37中还检测到合成基因PrnC;菌株A12、B37和B42产生嗜铁素;除了菌株A6和B37,其余菌株都产生蛋白酶;所有菌株都不产生几丁质酶。     

禾谷丝核菌环介导等温扩增检测技术体系的建立

为建立简便、快速和灵敏的小麦纹枯病菌——禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis的分子检测技术体系,基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为靶标序列,设计并筛选特异性引物,建立禾谷丝核菌的LAMP检测方法,并对其特异性、灵敏度和应用效果进行测定。结果表明,基于筛选获得的4条禾谷丝核菌特异性引物建立的LAMP方法能够从15种植物病原菌中特异性地检出禾谷丝核菌,近缘种立枯丝核菌Rhizoctonia solani和引致早期症状易混淆病害的病原菌禾顶囊壳菌Gaeumannomyces graminis、麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum均未检出;该LAMP方法在日光下的灵敏度为10^-1 ng/μL,在蓝光下的灵敏度为10^-3 ng/μL;对发病组织的检测显示该LAMP方法能从人工接种的小麦发病组织中...     

禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)原生质体制备与再生的研究

禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)是引起我国小麦纹枯病的主要致病菌。为了建立高效稳定的禾谷丝核菌遗传转化体系,本试验比较研究了不同细胞壁降解酶、酶液浓度、酶处理温度和时间等因素对禾谷丝核菌原生质体制备的影响,利用正交设计试验优化了原生质体再生条件。结果表明,液体培养6d的菌丝,采用15mg/mL溶壁酶+10mg/mL蜗牛酶组成的混合酶液,30℃下酶解4h,可以获得较高的原生质体释放量,可达到3.0×106个/mL;禾谷丝核菌原生质体再生的最佳条件是以SuTC缓冲液作为渗透压稳定剂悬浮原生质体,采用单层混菌法接种于TB3再生培养基,原生质体再生率可达到58.6%。禾谷丝核菌原生质体制备和原生质体再生条件的优化,为深入研究禾谷丝核菌生长发育的分子遗传学基础和进一步探索小麦纹枯病的致病机理奠定了基础。     

禾谷丝核菌拮抗细菌XZ18-3的分离、鉴定及其发酵条件优化

采用平板稀释法从土壤中分离菌株,用对峙培养法筛选出一株对小麦纹枯病病菌禾谷丝核菌拮抗效果好的菌株XZ18-3。经形态学观察、生理生化分析和分子生物学鉴定,确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis XZ18-3),并利用单因素试验和响应面法优化培养基成分,研究了菌株XZ18-3最佳培养条件。结果表明,菌株XZ18-3最佳培养基为葡萄糖2.00%、蛋白胨2.00%、MgSO_41.25%;其最佳发酵条件:发酵时间48 h、转速180 r/min、接菌量1.00%、pH 7.0。通过条件优化得到XZ18-3菌株发酵液的抑菌率为57.25%,比原发酵液活性提高了56.55%。     

喷雾诱导沉默CYP51和Sdh基因对禾谷丝核菌生长和致病性的影响

由于缺少稳定的遗传转化体系,丝核菌致病相关基因的功能研究受到严重限制。本研究以防治丝核菌病害的常用杀菌剂靶标基因CYP51和Sdh为目标基因,体外合成禾谷丝核菌CYP51的3个同源基因以及Sdh的B、C、D亚基基因的dsRNA,采用喷雾诱导基因沉默(spray-induced gene silencing, SIGS)方法研究这6个基因产生的dsRNA对病菌生长和致病性的影响。结果表明,外源施加靶标基因dsRNA对禾谷丝核菌的生长和致病性均有抑制作用。在被侵染的大麦叶片上,外源dsRNA能够显著抑制病菌中对应基因的表达。100 ng·μL^-1浓度的RcCYP51-3-dsRNA在大麦叶片上抑菌效果较为显著,且可以同时抑制3个RcCYP51同源基因的表达;RcSdhD-dsRNA同样可以抑制RcSdh三个亚基的基因表达,在50 ng·μL^-1浓度时抑菌效果最好。本研究探索了一种抑制禾谷丝核菌基因表达的方法,为使用SIGS方法研究丝核菌基因功能打下基础。     

在叶锈菌侵染过程中小麦过氧化物酶同工酶的变化

本文研究了抗叶锈性不同的小麦品种和毒力不同的叶锈菌小种相互作用过程中过氧化物酶(POD)同工酶谱的变化。结果表明:(1)不亲和组合在接种后48小时出现新酶带3,酶带4活性明显增强,120小时后又出现新酶带9。但亲和组合没有新酶带出现,而在接种后96小时酶带4活性也明显增强;(2)慢锈品种在接种后120小时以前,酶带4活性稍有增强,在120小时后其活性骤然增强。这可能是慢锈品种的特点。如果这些特点在更多的品种上得到验证,则POD同工酶谱分析有可能作为鉴定品种抗叶锈性和区分感病或慢锈品种的一种生理生化指标。     

选择性培养基在小麦纹枯病菌分离及土壤菌核检测中的应用

由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis,Rc)引起的纹枯病是黄海麦区的重要病害[1]。对病菌分离主要采用组织分离法[2]。该法费时、费力、操作要求严格,且无法对土壤中的病菌数量进行检测。选择性培养基(Selective medium,SM)是根据不同真菌对化学药剂敏感性的不同,通过向基础培养基中添加特定的抑菌物质,达到专一性分离目标真菌而有选择地抑制杂菌生长的目的。     

小麦纹枯病菌Rc-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用

Rhizoctonia cerealis is a soil-borne phytopathogenic fungus that causes wheat sharp eyespot, resulting in serious economic losses. In this study, the recombinase polymerase amplification combined with lateral-flow dipstick technology (Rc-RPA-LFD) was developed for the rapid and sensitivity detection of R. cerealis. The Rc-RPA-LFD assay could be completed at isothermal temperature of 38°C within 30 min without PCR thermal cyclers. The RPA primers and probe designed based on ITS region, showed high specificity to R. cerealis. The detection limit of Rc-RPA-LFD assay was 1 pg·μL^-1 fungal genomic DNA, showed an equal sensitivity to that of conventional PCR. In addition, the Rc-RPA-LFD assay could detect R. cerealis from field soil samples, showing no significant differences compared to conventional PCR assay. The simplicity, rapidly and practicability all indicated that Rc-RPA-LFD assay will be a promising molecular diagnosis for the accurate and rapid detection of R. cerealis.     

禾谷丝核菌对戊唑醇的抗性及抗药性菌系生物学特性

在含戊唑醇PDA平板培养基上，对禾谷丝核菌进行逐代处理，以诱导其抗药性菌系；比较抗性和敏感菌系的生物学特性，测定抗性菌系对其它杀菌剂的交互抗性。结果表明，选育至35代，对戊唑醇抗性达33．4倍。抗戊唑醇菌系与敏感亲本菌系相比，其菌丝生长速率、菌丝干重、菌核产生速率、菌核数及干重均存在差异。抗性菌系较敏感菌系对冬小麦幼苗的致病力减弱，但小麦返青后抗性菌系引起的发病率和严重度均较敏感菌系增强。戊唑醇抗性菌系对三唑酮、丙环唑、井冈霉素、福美双、噁醚唑和咯菌腈6种药剂分别产生了31．2、22．8、16．9、15．8、15．5和1．6倍的交互抗性。     

河南省小麦纹枯病菌及小麦全蚀病菌对丙环唑的敏感性

正小麦纹枯病和小麦全蚀病是河南省小麦生产上重要的土传病害,发病面积分别在300万和30万hm~2~([1,2])。近年来,由于小麦高产栽培措施(早播、密植、高肥)的推广,以及气候条件适宜、农机跨区作业等原因,两种病害的发生面积日益增大,     

小麦纹枯病菌对三唑酮不同敏感性菌株的生物学特性及对不同杀菌剂的敏感性

为预测小麦纹枯病菌对三唑酮抗药性的发展趋势,采用菌丝生长速率法测定了2013年分离自河南省16个地市的98株菌株对三唑酮的敏感性,比较不同敏感性菌株的生物学性状差异,并分析了其中22株菌株对其它10种杀菌剂的敏感性。结果表明:小麦纹枯病菌群体中已出现对三唑酮敏感性下降的菌株,其中有90株菌对杀菌剂的敏感性属于正态分布,以其EC_(50)均值1.91μg/mL作为小麦纹枯病菌对三唑酮的敏感性基线。敏感菌株菌丝生长速度较快,可达8.50~12.86 mm/d,菌核产量较多,为35.80~42.90 mg/皿,生存适合度较高;敏感性下降及抗性菌株的致病性及菌核萌发等都未发生改变,但菌丝生长速率仅为5.36~10.02 mm/d,菌核产量为9.00~36.90 mg/皿,均下降明显,生存适合度降低;低抗菌株与敏感菌株在菌落形态上相同,但菌丝分枝数增多且分枝菌丝变短。三唑酮对小麦纹枯病菌的毒力较小,EC_(50)大于其它10种杀菌剂;戊唑醇、氟环唑、烯唑醇、咯菌腈和噻呋酰胺的毒力均较大,其EC_(50)≤0.10μg/mL;其余5种杀菌剂的EC_(50)在0.13~0.69μg/mL之间;小麦纹枯病菌对三唑酮的敏感性与其它10种杀菌剂间的决定系数为0.003~0.200,存在微弱的正相关性,表明在生产中这些杀菌剂可与三唑酮轮换或交替使用。     

Nucleoside/nucleotide pools in wheat leaves naturally infected with Erysiphe graminis. I. Changes in the flag leaf

Nucleoside and nucleotide contents of the flag leaves of wheat plants, naturally infected with the powdery mildew fungus Erysiphe graminis were analysed in a field experiment. Fungicide treated plants were used as controls. Only low levels of infection occurred during the experiment (1% to 4% of the leaf area), but they resulted in higher leaf dry weight, and lower levels of chlorophyll, inorganic phosphate and NADP compared with the control plants. Although the total adenine nucleotide pools were the same in the flag leaves of infected and control plants, the energy charge values were slightly larger in the infected flag leaves. The total nucleoside content was higher in the infected flag leaves than the control; while the adenosine pool decreased, that of uridine increased strongly. Although the level of UDP-glucose was similar in the flag leaves of infected and control plants only decreasing slightly with time, UDP-N-acetylglucosamine, a precursor for fungal chitin biosynthesis, showed very different behaviour. The amounts of UDP-N-acetylglucosamine were very low in the control plants but increased greatly in the infected flag leaves to very high values (900nmol g⁻¹ d.wt) obviously reflecting exploitation of the hosts metabolism by the fungus for precursors for chitin biosynthesis. The size of the uridine pools was also correlated with the degree of infection and probably reflected recycling of the UDP moiety.     

四地区小麦纹枯病菌对6种杀菌剂的抗性比较

从山东和江苏的4个小麦产区采集分离了5个小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis菌株，为明确小麦纹枯病菌对不同杀菌剂的抗性现状，采用生长速率法测定了5个小麦纹枯病菌菌株对三唑酮、井冈霉素、戊唑醇、咯菌腈、丙环唑、苯醚甲环唑6种常用杀菌剂的抗性。结果表明：江苏镇江菌株（JZ）对三唑酮和井冈霉素的抗性分别高达20．46和23．31倍，山东聊城2个菌株（L1和L2）和泰安菌株（TA）对三唑酮的抗性分别为14．26、10．10和11．98倍，滕州菌株（聊）和泰安菌株（TA）对井冈霉素的抗性分别为14．92和10．46倍。5个菌株对戊唑醇、咯菌腈、丙环唑和苯醚甲环唑抗性均不明显，其中戊唑醇对小麦纹枯病的防治效果最好。     

玉米纹枯病菌全长cDNA文库的构建与鉴定

 以玉米纹枯病菌菌丝为材料,利用In-Fusion SMARTer^TM cDNA Lib Construction Kit构建玉米纹枯病菌全长cDNA文库。文库质量鉴定结果表明,文库滴度为1.2×10⁶pfu·mL^-1,重组率为99.2%,插入片段平均长度大于1.0 kb。随机挑取400个白色克隆进行测序,共获得329个高质量EST序列,经聚类拼接后得到250条unique EST,包括36条contigs和214条singletons。在GenBank 进行Blastn 与Blastx 同源比对,有227条EST 与已知核酸或蛋白有不同程度的同源性,占全部EST 的90.8%,其余23条无任何同源性,占9.2%。     

茎基腐亚洲镰孢菌侵染抗感小麦品种的组织病理学观察

小麦茎基腐是由多种镰孢菌侵染的世界性土传病害,亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)是我国冬小麦主产区茎基腐镰孢菌的优势种群,对小麦生产造成巨大损失。本研究利用绿色荧光蛋白报告基因标记亚洲镰孢菌,研究其侵染抗感小麦的病理组织学过程,建立了茎基腐病菌与寄主互作的直观性的研究体系,对病害防治及抗病育种具有重要意义。基于PEG-CaCl_2介导原生质体转化法将gfp导入亚洲镰孢菌株CF0915,对转化子进行荧光表达、PCR验证、遗传稳定性、生长特性及致病力分析,选取与野生型表现相近的转化子进行侵染分析。结果表明,绿色荧光蛋白基因(gfp)与潮霉素基因(hyg)PCR扩增表明gfp已整合入真菌基因组中,转化子菌丝与分生孢子表现强烈绿色荧光信号,gfp能够在转化子中稳定遗传,菌落形态、生长速度及致病力与野生型菌株无显著差异;将gfp标记病菌分生孢子接种感病品种1 d后,大量孢子附着于根毛及根表皮细胞开始萌发,接种2 d后观察到抗性品种分生孢子萌发;感病品种接种3 d后,菌丝直接侵入表皮细胞或沿表皮细胞间层定殖生长,扩展至皮层组织,8 d后菌丝从根部迅速扩展至茎基部,至第10 d大量菌丝充塞根皮层细胞,叶鞘维管束也被菌丝侵染,并产生大量大型分生孢子,植株表现褐色病斑,14 d后根部及茎维管束被大量菌丝体填充,而后产生大量厚垣孢子,至25 d大部分感病品种幼苗萎蔫死亡;与感病品种相比,抗性品种在整个侵染过程中表现时间滞后。本研究对引起茎基腐病的亚洲镰孢菌侵染小麦的组织学过程观察,为病菌致病机理的阐释及抗病资源的利用提供了重要理论依据。