猪伪狂犬病病毒LX株的分离与鉴定

从辽宁某猪场采集病料,经处理后接种BHK-21细胞进行猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10^-7.8 TCID₅₀/mL。间接免疫荧光试验可见黄绿色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径为140~200 nm。该病毒对氯仿、乙醚、酸和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的猪伪狂犬病临床症状且死亡。结果表明,成功分离到1株PRV。     

PRRSV云南株的分离与鉴定

从云南某猪场采取病料经RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)阳性,将其处理后接种到猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞上。接种后3 d,猪肺巨噬细胞开始出现细胞病变(CPE);Marc-145细胞盲传3代后,细胞也出现了CPE。对出现CPE的细胞培养物,用RT-PCR法、间接免疫荧光试验进行检测,结果均为PRRSV阳性;细胞培养物经PEG初步浓缩后,接种到PRRSV阴性,PRV、CSFV抗体阳性的仔猪,15 d后猪只出现体温升高并伴有食欲减退,精神不振等症状。采血并用同上的RT-PCR法检测,结果为阳性;采血用同上的RT-PCR法检测,结果亦为阳性;用电镜对纯化后的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,其直径约为50 nm;间接免疫荧光实验可见黄色荧光;TCID50测定其毒价为10-4.75/0.1 mL。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化(pH5.0或pH7.5)和热敏感;结果表明,已成功分离获得一株PRRSV云南地方流行毒株,命名为YN-1。     

高致病性猪蓝耳病病毒吉林株的分离鉴定及生物学特性

从吉林某猪场采集曾接种过猪繁殖与呼吸综合征疫苗的发病猪病料,经RT-PCR初步鉴定为猪繁殖与呼吸综合征病毒后,利用反转录合成cDNA,用针对PRRSV M、N基因片段设计的特异性引物进行扩增及电泳,在紫外凝胶成像系统下可见约为660bp特异性扩增条带。解剖发病仔猪,发现其有HP-PRRSV发病的特征,两耳及鼻端淤血,呈蓝紫色,肺部等内脏器官淤血呈暗红色。病理组织切片显示,病猪有典型的间质性肺炎的特征性病理变化。将其接种于Marc-145细胞后,在培养至第4代时出现典型的细胞病变（CPE）,表现为细胞聚集成丛、随后固缩、变圆、脱落;经Reed-Muench法计算得出两PRRSV分离株的病毒滴度分别为10-5.30 TCID50/0.1mL和10-5.53TCID50/0.1mL。用间接免疫荧光试验观察到在接种病料的Marc-145细胞胞浆内出现特异性荧光,而未接种PRRSV的细胞对照则未见到荧光反应。     

徐州地区牛流行热病毒的分离与鉴定

1991年夏秋之交徐州市各奶牛场暴发牛流行热。为确诊该病,采集了发病高热期抗凝血,进行了病毒分离和鉴定试验。病料经处理后,直接接种于BHK_21细胞,传至第二代可见典型的CPE。电镜下观察到80—150nm弹状病毒颗粒。分离毒的理化特性、核酸类型及中和试验结果均与标准BEFV相一致,证实该分离病毒为牛流行热病毒。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

采集临床疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料,经处理后进行细胞培养、电镜观察、半数细胞感染量测定、间接免疫荧光试验、动物回归试验以及RT-PCR检测,分离到1株病毒。分离株在Marc-145细胞上连续4代后出现特异性细胞病变;电镜观察到直径50~80 nm的病毒粒子,有囊膜;TC ID50为10-4.7/0.1 mL;与美洲型PRRSV阳性血清进行间接免疫荧光试验可见特征性荧光;RT-PCR检测结果为阳性;回归40日龄血清阴性仔猪可出现PRRSV感染的典型临床症状和病理变化,并且可检测到血清中的特异性抗体。结果表明分离株为PRRSV,命名为PRRSV-SCH07。     

禽腺病毒的分离鉴定及LMH细胞适应毒的生物学特性研究

为了对采集自北京平谷某养殖场发病鸡中出现心包积液综合征症状的病料进行病毒分离和鉴定,将病料接种LMH细胞进行病毒分离,并在LMH上连续传代,取C5和C15代细胞毒分别接种3周龄SPF鸡进行致病性试验。根据分离病毒在LMH上的CPE特征、病毒血清中和试验、Hexon基因序列比对分析、SPF鸡致病性回归试验,表明从发病鸡病料中分离的一株病毒为血清4型禽腺病毒;病毒在LMH细胞盲传3代后,就能很好地适应细胞培养,出现禽腺病毒典型的CPE;培养至第10代,病毒在接种后72 h,病毒含量即可达到107.4TCID50/0.1m L的峰值滴度;接种细胞毒的SPF鸡出现4型禽腺病毒导致的典型临床症状和特异性剖检病理变化,两组接种鸡的死亡率分别为100%和70%。结果表明,研究分离到的4型禽腺病毒毒株对SPF鸡具有高致死率,但病毒经过细胞连续传代后对鸡的致死率降低。     

一株猪高致病性蓝耳病病毒的分离鉴定与遗传变异分析

为研究猪蓝耳病病毒(PRRSV)的遗传进化规律,于2018年从新疆某猪场采集的病猪血液中分离了一株PRRSV,命名为XJ-b。对临床样品采用RT-PCR扩增鉴定,将阳性样品过滤处理之后接种在Marc-145细胞系进行培养,将盲传3代之后出现病变(CPE)的Marc-145样品进行间接免疫荧光鉴定。通过噬斑纯化后,利用RT-PCR对分离株的全基因组进行扩增,使用SeqMan软件对测序结果进行拼接,并根据NCBI上已公布的PRRSV全基因组及Nsp2基因核苷酸序列进行遗传进化与同源性比对分析。结果表明,临床病料RT-PCR检测呈PRRSV核酸阳性,处理后的病料接种至Marc-145细胞72 h之后产生CPE,间接免疫荧光鉴定为PRRSV抗原阳性;序列拼接显示分离株全基因组开放阅读框大小为15119 bp;全基因组和Nsp2基因核苷酸序列分析和同源性比对显示该分离毒株属于中国的高致病性PRRSV亚群。研究结果可为近年来新疆地区PRRSV的毒株差异分析提供参考。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

从蓝耳病疑似患猪病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒。试验采用细胞培养、RT-PCR、免疫荧光技术等进行病毒的分离和鉴定。结果表明:Marc145细胞接种出现典型的细胞病变,毒价为5.5×105 TCID50/m L,RT-PCR扩增出特异性长度为559bp的DNA片段,用PRRSV N蛋白单克隆抗体为一抗,羊抗小鼠Ig G-FITC为二抗进行免疫荧光检测,检测到接种病毒的Marc145细胞中特异性荧光信号。说明该分离株为猪繁殖与呼吸综合征病毒。     

鸭黄病毒SDbz株的分离与初步鉴定

鸭黄病毒病为近年来新发的鸭病,给养鸭业带来了极大的经济损失。为了深入研究本病的防制,本试验对鸭黄病毒(duck flavivirus,DFV)进行了分离鉴定。取疑似感染DFV的病鸭病料,经细菌分离初步排除细菌感染后,应用RT-PCR检测呈现DFV阳性,处理后将其接种到鸭胚成纤维细胞(DEF)和健康鸭胚上进行病毒分离传代。结果显示,在DEF细胞上第1代48 h就开始出现CPE,随着时间的延长CPE更加明显,通常在72~96 h产生典型CPE;接种鸭胚每一代均出现死亡,且死亡时间多集中于接种后60~72 h,死亡鸭胚胚体水肿、出血、发育不良、胚肝严重出血、肿胀或斑驳样坏死等病变。将病毒DEF细胞和鸭胚分离物应用血凝试验、毒价测定、病毒中和试验、RT-PCR及人工感染试验进行检测鉴定,证明所分离到的病毒为DFV,并将其命名为DFV SDbz株。     

猪流行性腹泻病毒SDbz株的分离与鉴定

病料应用套式RT-PCR检测呈现PEDV阳性,经处理将其接种到含终质量浓度50 mg/L胰酶的Vero细胞上进行病毒分离传代,盲传到10代左右开始出现局灶性CPE,20代以后特征性CPE稳定出现.将病毒Vero细胞培养物应用毒价测定及病毒中和试验、套式RT-PCR和间接免疫荧光进行检测鉴定,证明所分离到的病毒为PEDV,并将其命名为PEDV SDbz株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株的分离与鉴定

从河南省某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该病毒能在 Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变 (CPE),在 Vero、PK-15细胞上不出现CPE.该病毒能被猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清特异性地中和,用 PCR反应能扩增出 720 bp的特异性片段.分离病毒回归 30日龄仔猪可出现高热和呼吸道症状.初步鉴定该分离株为猪繁殖与呼吸综合征病毒.     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离与鉴定

试验旨在分离并鉴定从发病猪场分离的一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株。从某疫情猪场病猪体内分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-CHD。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),病毒滴度达10^-6 TCID50/0.1 mL,在Vero与BHK-21细胞上不出现细胞病变。采用间接免疫荧光法(IFA)检测病毒抗原分布在细胞浆中。与VR2332、CH-1a、HUN4序列比对及系统进化树分析结果表明,该分离株属于美洲型PRRSV;与PRRSV VR2332、CH-1a等比对,Nsp2基因序列在2780—2782 nt有3个核苷酸小缺失和2933—3019 nt的87个核苷酸大缺失,属PRRSV变异株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GD-ZQ变异株的分离及遗传变异分析

用RT-PCR方法从某猪场病猪体内分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),命名为PRRSV GD-ZQ株,可致Marc-145细胞病变。细胞分离培育病毒至增殖性能稳定后,分别扩增分离病毒的Nsp2、ORF3、ORF5基因并测序,绘制进化树比较分析遗传进化。结果显示分离毒株的Nsp2、ORF3、ORF5基因序列与美洲型VR-2332、CH-1a等毒株核苷酸序列相似性在89.0%~95.8%之间,与欧洲毒株LV的相似性在48.2%~49.3%之间,遗传进化分析显示该毒株与CH-1a株处于同一分支,分离毒株的Nsp2序列与以HEB1为代表的PRRSV变异株相似性在98.3%~99.4%之间。该病毒在细胞盲传5代能产生稳定规律细胞病变(CPE),且第5代病毒TCID₅₀达10^-5.6／0.1 mL。进化分析结果显示GD-ZQ分离株是PRRSV变异株,具有"高热病"PRRSV毒株的变异特点,为了解PRRSV在时间上和分子水平上的遗传变异规律、变异幅度和变异范围奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2 基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基〖JP2〗因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。     

杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒分离及其ORF6、ORF7基因的序列分析

试验旨在研究杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 辽宁分离株的遗传变异情况及分子生物学特征.用Marc-145细胞从辽宁某杂交野猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)病猪血液中分离到1株病毒,该分离毒株经Marc-145细胞6次传代后出现稳定的细胞病变,采用RT-PCR方法对分离病毒进行ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,并与已知序列毒株的相应片段进行同源性比对.结果表明,分离毒株的ORF6、ORF7基因与国内外美洲型毒株的核苷酸同源性分别为96.0%～100.0%、94.5%～99.4%;氨基酸同源性分别为89.6%～100.0%、87.3%～98.7%;与欧洲型代表毒株LV的ORF6、ORF7基因差异较大,核苷酸同源性分别为70.4%、70.1%,氨基酸同源性分别为48.8%、49.7%.推测辽宁杂交野猪体内分离毒株在基因型上属于美洲型毒株.     

靶向GP5基因脱氧核酶抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制

针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）JL/07/SW株GP5基因设计了4个脱氧核酶,经体外切割试验筛选得到具有体外切割活性的脱氧核酶,并通过RT-PCR、TCID50、CPE、间接免疫荧光（IFA）检测具有切割活性的脱氧核酶抑制PRRSV复制效果进行评价。结果针对GP5基因的Dz-GP5-10抑制效率最高可达到82.4%,Dz-GP5-12也表现良好的抑制效果,表明GP5基因的这2个位点可能是PRRSV复制所必需的。本研究为PRRSV复制及基因组功能研究、抗病毒药物开发和转基因动物研究奠定了基础。     

RNAi靶向GP5基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在MARC-145细胞中的复制

针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JL/07/SW株GP5基因设计了3个RNA干扰靶位,构建shRNA表达质粒;将转染干扰质粒6 h后的MARC-145细胞接种病毒,并通过Real-time RT-PCR、TCID50、CPE、间接免疫荧光检测(IFA)对所设计的shRNA表达质粒的干扰效果进行评价;结果表明,构建的干扰质粒可以高效抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制,说明GP5基因的这3个干扰靶位可能是PRRSV复制所必需的。本试验为PRRSV复制及基因组功能研究、抗病毒药物开发和转基因动物研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒辽宁分离株ORF5基因的克隆与序列分析

本试验以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的ORF5基因全长cDNA,结果该分离株ORF5基因编码区长603bp,可编码200个氨基酸。与美洲型代表株VR2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为89.5%和55.7%。推测该辽宁分离株属于美洲型。