孕牛乳中早孕因子的分离纯化

采用硫酸铵分级盐析、DEAE-52纤维素离子交换层析、G-100葡聚糖凝胶层析、ConA-Sepharose 6B LL亲和层析的方法分离纯化健康怀孕奶牛(妊娠4个月)乳中的早孕因子,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其肽图。结果表明:从孕牛乳中分离出EPF活性样物质,其蛋白含量为0.290 mg/mL,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳见2条蛋白带,其相对分子质量为21.0 ku、67.0 ku。说明这条分离纯化早孕因子的技术路线是可行的。     

乳清蛋白抗菌肽的分离纯化及活性

以乳清蛋白为原料,酶解制备具有抗菌能力的生物活性肽。采用超滤、葡聚糖凝胶层析色谱、反相高效液相色谱法对酶解液进行分离纯化,并对分离产物的氨基酸组成进行分析。结果表明:葡聚糖凝胶色谱纯化最佳流速2 mL/min,最佳样品质量浓度15 mg/mL;再由反相高效液相色谱分离的高活性抗菌肽,抑菌圈直径达到31.33 mm。氨基酸分析结果显示,高活性抗菌肽碱性氨基酸和疏水性氨基酸含量最多,分别为42.69%和37.39%。     

发酵牦牛乳蛋白肽的分离纯化及抗氧化活性研究

以牦牛乳为原料,从6株乳酸菌中筛选出对发酵牦牛乳具有较高水解度及肽得率的罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌,并与保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和发酵乳杆菌按1:1:1:1:1复配发酵剂制备牦牛乳蛋白肽。通过离心提取发酵牦牛乳蛋白肽,经超滤和Sephadex-25柱层分离纯化蛋白肽,并测定各分离组分的体外抗氧化活性。结果表明,发酵牦牛乳蛋白肽的Sephadex-25分离纯化的最优工艺条件为:洗脱液浓度0.2mol/L,上样质量浓度50mg/mL,洗脱流速2mL/min,在此条件下一共分离出峰1、峰2两个组分。随着蛋白肽各分离组分浓度的增加,其抗氧化活性显著增强,分离组分峰1、峰2对ABTS自由基清除率的IC_(50)为1.778mg/mL、3.844mg/mL,对DPPH自由基清除率的IC_(50)为1.801mg/mL、3.286mg/mL,还原能力IC_(50)为0.571mg/mL、1.365mg/mL,对羟自由基清除率的IC_(50)为0.913mg/mL、2.466mg/mL。     

孕牛血清中早孕因子的分离纯化与鉴定

为了从妊娠4~5个月健康孕牛血清中分离得到纯化的早孕因子(EPF),通过DEAE-Sepharos F.F离子交换层析,CM–Sepharose F.F离子交换层析,Con A-Sepharose 4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl 6B亲和层析分离纯化技术,从孕牛血清中分离出纯化出EPF。采用玫瑰花环抑制实验(Ea-RIT)对各阶段产物EPF活性进行检测,最终纯化出具有早孕因子活性的HE-2成分。将HE-2经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)出现分子量为53.6KU蛋白质条带。该方法得到分离纯化的EPF,为进一步研制早孕因子单克隆抗体的制备做准备。     

基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中SIgA

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是黏膜免疫的主要效应分子，在临床上常常作为疾病早期诊断的靶标，此外，基于SIgA的治疗性单抗和靶向SIgA产生的黏膜疫苗也越来越受到关注。分离并纯化出完整且具有活性的SIgA是产品研发的前提。为了提高猪初乳中SIgA的纯化效率，本研究采用串联亲和层析，强阴离子柱和精细分子筛层析进行纯化，从10 mL初乳中获得3 mg具有活性的SIgA。使用Western blot对纯化的SIgA进行鉴定，结果表明，纯化的SIgA与抗猪的重链蛋白单抗和抗SC单抗均具有良好的反应性。使用ELISA测试SIgA与抗猪的IgA重链单抗的反应性，结果发现使用本方法纯化的SIgA较原先方法(即硫酸铵沉淀，DEAE52弱阴离子层析，SephadexG-200凝胶层析和多次亲和层析的纯化方法)具有更高的反应性。最后使用质谱鉴定纯化的蛋白，结果表明为猪的SIgA。本研究为从猪初乳中纯化SIgA建立了一种高效的纯化方法，也为其它来源的SIgA的纯化提供参考。     

髓过氧化物酶检测奶牛隐性乳房炎研究进展

奶牛隐性乳房炎的检测方法有多种,相比之下,近年来,国外报道的用检测奶样中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)来诊断奶牛隐性乳房炎的方法更符合快速、简便、高灵敏度、高特异性的现代诊断方法要求。根据乳房炎过程中的生理生化指标的变化特点,可得出奶液中MPO是乳房炎指示物。奶样中的体细胞数(SCC)和MPO浓度的相关系数值为0.91,奶样中随着SCC的增高,MPO的水平也增高达到2 000 ng/mL,同时也可分离到大量细菌。免疫学分析MPO单克隆抗体与奶液中成分乳铁蛋白、乳过氧化物酶、牛血清白蛋白、MPO、淋巴细胞、少量体细胞的乳样之间ELISA反应没有交叉性,表明MPO分子在乳房炎中具有很高的特异性。通过对牛奶中MPO的检测来判断乳房内中性粒细胞(PMN)的活性状态,可对奶牛隐性乳房炎做出早期诊断。     

麻黄提取物中抑制桑椹肥大性菌核病病原菌的活性成分分离鉴定

由桑实杯盘菌(Ciboria shiraiana)侵染引发的桑椹肥大性菌核病是发生最为普遍的一种桑椹菌核病,对果桑生产的危害极大,从植物中寻找有抑菌活性的物质用于病害防治,对保障桑果丰产和食用安全等具有重要意义。分别用17种中草药提取物对桑实杯盘菌进行抑菌活性试验,筛选出抑菌效果最好的中草药麻黄。进一步通过有机溶剂萃取、色谱层析等方法,从麻黄提取物中分离纯化出主要的抑菌活性化合物,鉴定该化合物为肉桂酸(cinnamic acid,C9H8O2)。用0.30 mg/mL肉桂酸处理桑实杯盘菌,60 h以内对病菌的平均抑制率保持在80%以上,半数抑制浓度(IC50)为0.118 mg/mL。研究结果提示:从麻黄中分离鉴定的肉桂酸具有开发成为新型、安全的桑椹肥大性菌核病防治药剂的潜力。     

板栗花粉总黄酮的分离纯化工艺研究

AB-8大孔吸附树脂柱层析分离纯化板栗花粉总黄酮,理想的分离纯化工艺参数为：有效柱体积20mL,黄酮液上样量6mL,水洗液10BV,洗脱液乙醇浓度为75%,洗脱速度1mL/min,洗脱液用量为树脂床6BV时,黄酮物质基本被洗脱下来,HPLC表征板栗花粉黄酮得到分离纯化。     

屎肠球菌荚膜多糖的提取纯化及其多糖含量的测定

为提取纯化屎肠球菌（E.faecium）荚膜多糖（CPS）并测定其多糖含量,试验采用高压法破碎菌体,加入核糖核酸酶（25 μg/mL）、脱氧核糖核酸酶（0.5 mg/mL）、溶菌酶（0.25 mg/mL）及蛋白酶K （1.25 mg/mL）等去除核酸和蛋白质,得到荚膜多糖粗提物,经过30 ku和100 ku超滤离心管超滤浓缩和DEAE Sepharose Fast Flow层析柱层析后,得到纯化的屎肠球菌荚膜多糖,再利用苯酚-硫酸法测定其含量。结果表明,成功从屎肠球菌中提取纯化出荚膜多糖,其含量为75.21%,初步确定了屎肠球菌荚膜多糖的提取纯化方法,为今后相关疫苗的研制奠定了基础。     

莆田黑猪精液中NAGase酶学特性研究

试验对以莆田黑猪精液为材料分离纯化得到的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)进行了理化特性研究。经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G100分子筛层析获得PAGE电泳纯化的NAGase酶制剂。以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-GlcNAc)为底物,研究酶催化水解的相关性质。分离纯化获得的酶制剂比活力为1561.42 U/mg,分子质量为58 ku,只有1个亚基,等电点pI为9.13。酶的最适pH为5.6,最适温度为45 ℃,酶在pH 3.6～7.8之间稳定,当pH>8时迅速失活,在50 ℃以下处理30 min酶活力保存稳定,高于50 ℃时,酶活力迅速降低。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,米氏常数K_m为0.82 mmol/L,最大反应速度V_m为39.23 μmol/(L·min)。催化pNP-GlcNAc反应的活化能为27.30 kJ/mol。金属离子中Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活力无明显影响,Zn²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺对酶有抑制作用。     

Plasma myeloperoxidase level and polymorphonuclear leukocyte activation in horses suffering from large intestinal obstruction requiring surgery: preliminary results.

Myeloperoxidase (MPO) is a specific enzyme of neutrophil azurophilic granules with a strong oxidative activity. Thanks to a radioimmunoassay of equine myeloperoxidase, the authors have observed a significantly higher plasma level of MPO in horses operated for strangulation obstruction of the large intestine (n = 6) than in horses suffering from a non-strangulating displacement of the large intestine (n = 9). For the 2 groups, 3 phases were distinguished: reception (P1), intensive care (P2) and terminal phase (P3). The mean peak values of MPO for these phases were 121.6 ng/mL (P1), 168.6 ng/mL (P2), and 107.0 ng/mL (P3) for the non-strangulating group, and 242.6 ng/mL (P1); 426.0 ng/mL (P2), and 379.5 ng/mL (P3) for the strangulation group. The variations of the mean peak values of plasma MPO were significantly different between the 2 groups and between the different phases. A significant increase of the least square means of MPO was observed between P1 and P2. A significant decrease of the least square means of the number of circulating leukocytes was observed between P1 and P3. Polymorphonuclear neutrophil activation could play a major role in the pathogenesis of acute abdominal disease and endotoxic shock.     

Purification of myeloperoxidase from equine polymorphonuclear leucocytes.

Increases of plasma concentrations of neutrophil myeloperoxidase (MPO) can be used as markers of polymorphonuclear leucocytes (PMN) activation in pathological situations (sepsis, acute lung injury, acute inflammation). To develop an assay for measurement of plasma MPO in horses during the above-mentioned infectious and inflammatory conditions, MPO was purified from equine PMN isolated from blood anticoagulated with citrate. PMN were extracted in a saline milieu (0.2 M Na acetate, 1 M NaCl, pH 4.7) to eliminate most of cellular proteins. Pellets were then extracted in the same buffer containing cationic detergent (1% cetyltrimethyl ammonium bromide). The supernatant was further purified by ion exchange chromatography (Hiload S Sepharose HP column 0.5 x 26 cm, equilibrated with 25 mM Na acetate, 0.2 M NaCl, pH 4.7) with a NaCl gradient (until 1 M). Most of the peroxidase activity of MPO (spectrophotometrically measured by the oxidation of orthodianisidine by hydrogen peroxide) was eluted at 0.65 M NaCl. MPO was further purified by gel filtration chromatography (Sephacryl S 200 column 2.6 x 42 cm with 25 mM Na acetate, 0.2 M NaCl, pH 4.7). MPO (specific activity: 74.3 U/mg) was obtained with a yield of 30% from the detergent extraction supernatant. Electrophoresis (non-reducing conditions) showed 3 bands identified, by comparison with human MPO, (i) the mature tetrameric enzyme (150 kDa) with 2 light and 2 heavy subunits, (ii) the precursor form (88 kDa) and (iii) a form of the heavy subunit without the prosthetic heme group (40 kDa). The mature enzyme and its precursor were glycosylated and possessed peroxidase activity. Equine MPO showed strong similarities with human and bovine MPO, with an absorption peak at 430 nm (Soret peak) characteristic of ferrimyeloperoxidase. Enzymatic activity was pH dependent (optimal value at pH 5.5).     

喹胺醇与鸡血浆蛋白结合的初步研究

采用平衡透析法结合反相高效液相色谱法（RP—HPLC）测定鸡血浆中喹胺醇的蛋白结合率。色谱条件为ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（250mm×4．6mm,5μm）,流动相为乙腈：水（40：60,v／v）,流速1．0mL／min,检测波长352nm。结果显示,喹胺醇浓度为1．1、5．5、22．0μg／mL缓冲液中鸡血浆的蛋白结合率分别为84．41％、75．30％、66．96％;透析平衡时间约为30h。表明喹胺醇的鸡血浆蛋白结合率较高,药物浓度与血浆蛋白结合率之间呈反比关系。     

原儿茶酸对LPS诱导的小鼠子宫内膜炎的作用机制研究

【目的】 探究原儿茶酸对脂多糖(LPS)诱导的小鼠子宫内膜炎的作用机制。【方法】 将60只小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS+不同浓度原儿茶酸(20、40、80 mg/kg)组共5组,每组各12只。对照组小鼠用微量注射器经阴道灌注50 mL生理盐水,LPS组灌注50 mL LPS(1 mg/kg),原儿茶酸治疗组灌注50 mL LPS前1 h分别腹腔注射20、40、80 mg/kg原儿茶酸,注射24 h后,颈椎脱臼法处死所有小鼠。收集子宫组织,通过HE染色检测子宫组织病理变化,用试剂盒检测髓过氧化物酶(MPO)活性,ELISA法检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6含量;Western blotting法检测p65、核因子-κB(NF-κB)的抑制蛋白(IκB)以及磷酸化p65、IκB(p-p65、p-IκB)蛋白表达水平。【结果】 组织病理结果显示,对照组小鼠子宫组织形态正常,子宫内膜上皮结构正常;LPS组小鼠子宫组织出现严重的炎性细胞浸润和子宫内膜上皮充血及水肿。与LPS组相比,随着原儿茶酸浓度的增加,小鼠子宫组织中炎性细胞明显减少,子宫内膜上皮充血水肿情况也明显得到改善。MPO活性检测表明,与对照组相比,LPS组MPO活性极显著升高(P<0.01);与LPS组相比,原儿茶酸治疗组MPO活性均极显著降低(P<0.01),并呈剂量依赖性。ELISA结果表明,与对照组相比,LPS组小鼠子宫内膜组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均极显著升高(P<0.01);与LPS组相比,原儿茶酸治疗组小鼠子宫内膜组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均极显著降低(P<0.01),并呈剂量依赖性。Western blotting结果表明,与对照组相比,LPS组p-p65和p-IκB的表达水平均极显著升高(P<0.01);与LPS组相比,原儿茶酸治疗组p-p65和p-IκB的表达水平均极显著降低(P<0.01),且呈剂量依赖性。【结论】 原儿茶酸通过减轻子宫组织的病理变化,降低子宫组织MPO活性,抑制NF-κB信号通路及炎症细胞因子的产生,对LPS诱导的小鼠子宫内膜炎起到保护作用。     

Method for co-purification of equine neutrophil elastase and myeloperoxidase from a limited blood volume

Neutrophil myeloperoxidase (MPO) and elastase can be released in severe inflammatory diseases and cause tissue injuries. Equine enzymes have already been individually purified from large blood quantities. We describe the isolation of both enzymes from a same limited blood volume. Both MPO and elastase were extracted by crushing PMN isolated by centrifugation on a percoll-gradient from a 460 ml blood collection. MPO and elastase were separated by an ionic exchange chromatography phase and further purified by gel filtration chromatography on Superdex 200 and 75, respectively. Enzymes were identified in the collected fractions by specific enzymatic assays. The final purity was verified by electrophoresis. Specific activity was improved to 19.92 and 34.3× for elastase (final yield: 340 μg) and MPO (final yield: 130 μg), respectively, during the procedure. Results show the possibility of isolating both enzymes from the same blood sample with a sufficient yield and purity for future studies on their implication and interaction during inflammatory diseases.     

西番莲多糖提取物对猪圆环病毒2型感染RAW264.7细胞氧化应激的影响

为研究西番莲多糖提取物（Passiflora edulis polysaccharide extract，PEPE）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）感染RAW264.7细胞氧化应激相关因子的影响，本试验探讨了PEPE对氧化应激的调节作用。在96孔细胞培养板中每孔加入100 μL浓度为1×10⁶个/mL的RAW264.7细胞，分别设细胞对照组、PEPE组（25、50、100、200、400、800和1 600 μg/mL），分别于培养箱培养24和48 h，用MTT法检测细胞活性，筛选PEPE的药物安全浓度范围。试验分为以下6个组：细胞对照组、病毒组、PEPE高（400 μg/mL）、中（200 μg/mL）、低（100 μg/mL）剂量组及维生素C组，其中细胞对照组加入含10% FBS的DMEM培养液，其余组加入PCV2病毒液，孵育2 h后在PEPE组加入对应浓度的PEPE溶液，VC组加入配制好的VC溶液，细胞对照组和病毒组加入含10% FBS的DMEM培养液，培养48 h，同样用MTT法检测细胞活性，以研究PEPE对PCV2感染RAW264.7细胞活性的影响。按照上述6个试验组分组，处理同上，将细胞培养12 h，收集样品用于检测氧化应激相关因子水平。用Griess法和DCFH-DA荧光探针分别检测RAW264.7细胞上清中NO含量和细胞内活性氧（ROS）水平、OPT荧光法检测细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量，化学发光法检测细胞内黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力。结果显示，PEPE对RAW264.7细胞的安全浓度范围为25~400 μg/mL。PCV2感染RAW264.7细胞后，细胞活性显著降低（P<0.05），而不同浓度PEPE处理组均能提高细胞活性。RAW264.7细胞被PCV2感染后，细胞分泌NO、ROS水平，GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性显著升高（P<0.05），感染细胞GSH含量显著降低（P<0.05）；PEPE作用于PCV2感染的RAW264.7细胞，显著降低感染细胞NO、ROS水平、GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性（P<0.05），100 μg/mL PEPE处理组细胞GSH水平显著升高（P<0.05）。本试验结果表明，PEPE能提高PCV2感染RAW264.7细胞的抗氧化能力，有利于缓解病毒感染所致氧化应激。     

中药联合益生菌对大肠杆菌性小鼠腹泻的保护作用

【目的】研究中药联合益生菌对大肠杆菌性小鼠腹泻的保护作用。【方法】通过正交试验筛选中药联合益生菌最佳因素配比。取60只小鼠随机分为空白组、模型组、中药组、益生菌组和中药联合益生菌组,每组12只。空白组小鼠腹腔注射生理盐水(0.2 mL/只),模型组、中药组、益生菌组和中药联合益生菌组均先腹腔注射分离菌悬液1×10⁷ CFU/kg,然后中药组按10 mL/kg灌胃中药液(其中蒲公英提取物浓度为0.25 g/mL,黄芪总黄酮和黄芪多糖浓度均为0.05 g/mL),益生菌组按4 mL/kg灌胃枯草杆菌悬液(菌含量5×10⁷ CFU/mL),中药联合益生菌组按上述量灌胃中药液和枯草杆菌混合液,每天定时灌胃给药1次,连续3 d。每日记录小鼠腹泻、体重、采食量等情况。末次给药12 h后分离心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏,称重并计算脏器系数;血液分析法检测血液学指标;取粪便及小肠内容物检测粪便隐血情况并进行细菌计数;ELISA法检测小鼠血清和小肠组织中髓过氧化物酶(MPO)活性。【结果】中药联合益生菌最佳因素配比为A₁B₂C₂D₂。与空白组相比,模型组小鼠腹泻率100%且无自愈现象,症状和剖检病变明显,腹泻指数极显著上升(P＜0.01),体重、采食量均极显著下降(P＜0.01),肝脏、脾脏器官指数均显著升高(P＜0.05),淋巴细胞比率(LYM)、中间细胞比率(MID)均显著下降(P＜0.05),粒细胞比率(GRAN)极显著上升(P＜0.01);与模型组相比,中药组和中药联合益生菌组腹泻指数极显著下降(P＜0.01),体重、采食量显著上升(P＜0.05),中药组肝脏、脾脏器官指数显著下降(P＜0.05),中药联合益生菌组脏器系数极显著下降(P＜0.01),中药组、益生菌组及中药联合益生菌组LYM显著上升(P＜0.05)、GRAN显著下降(P＜0.05)。粪便隐血检测结果显示,模型组检测呈强阳性;中药组、益生菌组呈弱阳性,中药联合益生菌组呈阴性。与空白组相比,模型组小鼠肠内大肠杆菌数、血清及小肠组织中MPO活性均极显著上升(P＜0.01);与模型组相比,中药组和中药联合益生菌组小鼠肠内大肠杆菌数、血清及小肠组织中MPO活性均显著下降(P＜0.05)。【结论】中药联合益生菌可降低腹泻指数、肝脏和脾脏器官指数,增加体重、饮食量,使粪便隐血转阴并降低肠内大肠杆菌数、血清及小肠组织中MPO活性,从而对大肠杆菌性小鼠腹泻产生协同保护作用。     

小鼠髓过氧化物酶(MPO)基因克隆分析及真核表达载体的构建

髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一种血红素辅基蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一,参与多种疾病的发生和发展过程.本研究旨在克隆小鼠MPO基因CDS全长序列,检测该基因在小鼠神经细胞的表达谱.首先利用RT-PCR法与克隆载体克隆小鼠MPO基因CDS全长序列,对其进行生物信息学分析;然后构建真...