农杆菌介导棉花基因转化的研究

以棉花无菌苗下胚轴为外植体,通过愈伤组织培养,使供试的20个棉花新品种(系)中19个培养出体细胞胚或再生植株.在此基础上,选用易获得再生植株的邯93-2、邯无2031、衡无89-30、C201、C312,利用农杆菌介导转化Bt基因,抗卡那霉素愈伤组织诱导率约为50%,其中约40%表现GUS阳性.从邯93-2 GUS阳性愈伤中获得再生植株,其50%呈GUS阳性,且Bt基因的导入经Southern杂交验证.     

转Cry1C*基因抗虫水稻的培育

水稻害虫是影响吉林省水稻产量的主要限制因素,为培育抗虫转基因水稻新品种,本研究采用农杆菌介导的遗传转化法,将人工合成的Cry1C*基因导入吉林省主栽粳稻品种吉粳88和吉利518中,共获得410个独立转化株.通过对转基因植株PCR检测,阳性率为67.2％; ELISA检测结果表明:不同株系Bt毒蛋白含量变化较大,变幅为0...     

农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti）在玉米中的遗传转化

在众多玉米转化方法中,农杆菌法是很有发展潜力的手段之一,它具有诸多优点:操作简便,一次性处理材料量大,成本低,可转化的外源DNA长,且外源基因大多为单拷贝插入.     

Gus基因在转基因棉花细胞中的表达及其与 NPTⅡ基因、Bt基因表达的相关性

通过农杆菌介导法将含有 Gus 基因、NPTⅡ基因、Bt基因的Ti质粒转入棉花细胞中,用Gus组织化学检测法检测转化愈伤组织、再生棉株R0、R1和R2代植株组织细胞中的 Gus 基因表达的水平,并用 NPTⅡ活性速测法和室内生物测虫法检测三个外源基因在 R0、R1和R2 代植物植株组织中的表达情况,分析三者存在及表达的相互关系.结果表明,Gus基因在转化愈伤组织细胞有丝分裂增殖过程中能稳定遗传给后代细胞.转化棉株 R0、R1和R2代Gus 活性、NPTⅡ活性、抗虫性三者有一定的相关性但不完全是共表达的,各基因的表达水平是多相的.     

棉花外源基因导入及转基因再生植株条件的研究

用５～６ｄ的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培,菌株质粒中Ｇｕｓ基因为标记基因,ＮＰＴⅡ基因为选择基因。在含０．１ｍｇ·Ｌ－１２,４－Ｄ和０．１ｍｇ·Ｌ－１ＫＴ的ＭＳ培养基上共培４８ｈ,转移到添加头孢霉素５００ｍｇ·Ｌ－１,卡那霉素５０ｍｇ·Ｌ－１的ＭＳ培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织,７０～８０ｄ时,进行ＧＵＳ检测,选择ＧＵＳ阳性愈伤组织,经体细胞分化生成转基因再生植株。     

农杆菌介导外源基因在棉花中的表达

用 5～ 6d的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培养 ,菌株质粒中 Gus基因为标记基因 ,NPT 基因为选择基因。在含 0 .1 mg· L- 12 ,4- D和 0 .1 mg· L- 1KT的 MS培养基上共培 48h,转移到添加头孢霉素 50 0 mg· L- 1、卡那霉素 50 mg· L- 1MS培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织 ,70～ 80 d时 ,进行 Gus检测 ,选择 Gus阳性愈伤组织 ,经体细胞分化生成转基因再生植株     

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础.     

农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转acsB基因植株

本文以花粉作为受体细胞,在农杆菌介导下将外源基因导入花粉中,然后通过人工授粉获得转化种子。以花粉作为受体的转化方法,其优点是它避开了传统基因转化方法所需的组培过程,含外源基因的花粉可与卵细胞自然结合,产生的转化体不存在转化与非转化细胞间的嵌合现象.……     

农杆菌介导的大花蕙兰转ICEl基因

大花蕙兰属热带植物,在北方组培成本很高,从拟南芥的RNA中克隆到耐寒基因(COR)的转录激活因子ICE1,连上CaMV35S启动子构建成植物表达载体pCAM BIA1300-35S.ICEl-poly,通过农杆菌介导的方法转化大花蕙兰.经过抗性筛选、诱导生芽、诱导生苗、诱导生根等过程.获得了70多棵潮霉素抗性植株,PCR鉴定12.9%为阳性.且部分PCR阳性植株通过了Southern检测,确定为转基因植株.     

中国转基因抗虫棉的研究利用现状及发展对策

（湖南农业大学棉花研究所,长沙 410128）     

抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株

构建了一种新的植物高效表达载体pAM12-s1m,其上携带有通过基因优化(gene shuffling)技术获得的抗草甘膦突变基因（aroAM12）和抗虫人工合成重组Bt基因（Bts1m）。aroAM12基因表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因表达由2E-35S启动子和Ω因子控制。以棉花无菌苗下胚轴为外植体,采用农杆菌介导法将aroAM12和Bts1m基因导入棉花     

转基因双价抗虫棉中Cry1Ac基因与CpTI基因的共表达

以转基因双价抗虫棉自交后代为材料,利用PCR、Southern杂交、ELISA检测方法,分析了Cry1Ac基因与CpTI基因在基因组中的整合情况,结果显示,除sGK321和3517外,其余品种Cry1Ac基因和CpTI基因的整合位点不同,并且sGK321中两基因也只有一个位点相同;ELISA结果表明,同一个品种同一部位Cry1A蛋白和CpTI蛋白不能完全同步表达,它们的表达量存在差别,且这种差别在整个生长阶段并不稳定.     

转Bt+Sck基因双价抗虫棉的抗虫性及遗传分析

对通过花粉管通道注射获得的转Bt Sck双价基因抗虫棉纯系312-5T2和332-2T2进行了生物抗虫性测定,转基因纯系对棉铃虫的抗性显著高于非抗虫对照苏棉16和抗虫对照品种sGK321,与抗虫对照R19抗虫性相当.遗传分析表明,转Bt Sck双价基因抗虫棉的抗性基因符合一对显性基因的分离规律.对转Bt Sck双价基因抗虫棉与R19及sGK321的杂交F1进行了抗虫性测定,所有的F1植株都表现出与转Bt Sck基因纯系亲本一致的抗虫性.转Bt Sck双价基因抗虫棉纯系312-5T2和332-2T2等位性测验证明:312-5T2与R19、sGK321的抗虫基因整合位点不连锁,表现为15∶1的自由组合比例;而332-2T2与R19中抗虫基因的整合位点表现连锁,与sGK321的抗虫基因表现自由组合.这为培育新的双价抗虫棉品种(系)提供了优良的育种材料.     

选择标记基因剔除及其在转基因棉花中的应用

转基因植物中选择标记基因可能对生物安全和环境安全带来的不利影响,有必要进行剔除。评述了剔除选择标记基因的几种方法,并设计了利用双T DNA共转化和位点特异性重组的方法初步建立培育无选择标记转基因棉花的体系。     

The Study on the Transformation and Selection of Insect-resistant Cotton Harboring Double-gene

采用花粉管通道法,将人工合成的ＧＦＭＣｒｙＩＡ和修饰的ＣｐＴＩ杀虫基因导入棉花优良品种（系）中棉所２３、中棉所２７、中９４０９和中９０系。经田间选择和室内生物鉴定,已获得了转基因抗虫植株。依据生物鉴定结果,对所获得的抗虫材料进行了ＰＣＲ分析,结果证明Ｂｔ和ＣｐＴＩ基因均整合于相应的抗虫材料染色体基因组中,通过自交选育,双价抗虫基因能够传递至ＺＧＫ９７０８抗虫材料Ｒ３代。抗虫鉴定表明,双价抗虫基因能够遗传,后代抗虫性稳定;在获得的Ｒ１代植株中,不同转化体对棉铃虫的抗性存在着差异。     

中国转基因抗虫棉的应用及发展对策

从20世纪90年代起,中国开始了转基因抗虫棉的研究、开发和利用。转基因抗虫棉最常用的外源基因是Bt基因和CpTI基因。这两种基因已被分别或同时导入棉株中并获得了一批有发展前景的转基因棉花品种,其种植面积占棉花总面积的比例由1996年的0.35%上升到2000年的30%。目前在我国推广种植的抗虫棉,存在的主要问题是抗虫性的时空变化大、害虫抗性、抗虫范围狭窄、抗虫强度差及抗虫棉的安全管理。解决这些问题的方法主要有寻找和筛选广谱抗虫基因,采用特异启动子和诱导表达启动子,培育转多基因抗虫棉,加强转基因抗虫棉的种植管理及安全性评价研究。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂转基因棉花的获得

利用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂（Ｃｏｗ－ｐｅａＴｒｙｐｓｉｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＣｐＴＩ）基因转移进入棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）。棉花幼苗的下胚轴与携带有ＣｐＴＩ基因和Ｎｐｔ－Ⅱ基因的根癌农杆菌共培养,在选择培养基上诱导出了卡那霉素抗性（Ｋｍｒ）愈伤组织。选择Ｎｐｔ－Ⅱ阳性的胚性愈伤组织在胚状体诱导培养基上进行胚状体诱导,继而在分化培养基上进行植株分化,最终获得了再生棉花植株。经Ｎｐｔ－Ⅱ分析、ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测证明,外源ＣｐＴＩ基因和标记基因（Ｎｐｔ－Ⅱ基因）存在于转化棉株及其后代中。抗棉铃虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａ）生物活性检测表明转基因植株后代具有明显的抗棉铃虫能力。     

转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花株系对黄萎病的抗性

 采用人工病圃、重病田及苗期室内鉴定相结合的方法,研究了转双价（Chi+Glu）基因的棉花株系61217-1对棉花黄萎病的抗性。结果表明,转基因棉花株系61217-1在人工病圃连续3年达抗病水平,病指极显著低于其受体中棉所24。2009年该转基因株系在河南安阳、江苏大丰及新疆石河子棉花黄萎病重病田的病指分别为18.7、18.1和16.7,均极显著低于受体中棉所24的病指。该转基因株系对来自河北、湖北、新疆的3个强致病力落叶型菌株均达抗病水平,病指分别为16.4、16.8和15.6,也极显著低于受体中棉所24的病指。表明转双价（Chi+Glu）基因的棉花株系61217-1具有优异稳定的抗黄萎病性。     

陆地棉抗虫品种不同年份间农艺性状的比较

笔者对3个陆地棉抗虫品种在两年间的农艺性状和纤维品质性状进行了研究。结果表明,3个抗虫棉品种的产量性状年份间表现基本一致,而纤维品质性状差异较大。新棉33B在3个抗虫棉品种中产量性状表现最好。品种与年份的互作极为显著,2002年新棉33B在籽棉产量和皮棉产量上显著高于对照品种中棉所12号,而在2003年则与对照品种产量相当。JS166在单株籽棉产量和单株皮棉产量、单株铃数、单铃重等性状上两年间表现均较好,2003年还有较低的蕾铃脱落率。99035两年间在产量性状上与对照相比略有提高,但差异并不明显。所有3个抗虫棉品种2002年的纤维品质指标与对照相当,而2003年纤维长度和纤维整齐度明显高于对照。