程序化冷冻对小鼠胚胎发育的影响

取小鼠原核(220枚)、2～4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至于宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响.结果表明:原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2～4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2～4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2～4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率.     

牛老化卵体外受精后的胚胎发育速度与细胞遗传学研究

体外成熟培养的牛老化卵受精后发育到囊胚期速度减慢.囊胚期的发育率分别为22h培养组为35.3%,34h组23.6%,46 h组15.4%,胚胎的发育速度随培养时间的延长而明显减慢(P＜0.05).46h组的囊胚期胚胎的平均卵裂球数明显少于22h组(P＜0.05),老化组的染色体平均分裂像、分裂指数均明显低于对照组(P＜0.05).染色体异常发生率46h组高于22h组.     

不同浓度的FBS和hLIF对小鼠原核期受精卵体外发育率的影响

通过在mM16培养液中添加不同浓度的FBS及hLIF,探讨小鼠原核期受精卵的体外培养条件,旨在建立稳定的小鼠原核期受精卵的体外培养系统。实验结果表明:在mM16中添加10%或15%的FBS都可降低胚胎在体外的发育率,其体外囊胚发育率与对照组mM16(未加血清组)差异显著(73.3%对32.6%;73.3%对35.8%);5001、0001、500 IU/ml 3种不同浓度的hLIF都可提高小鼠受精卵体外发育率,三者之间差异不显著,但以添加1 000 IU/ml hLIF组中,桑椹胚/囊胚率及囊胚脱出率为最高。结论:在mM16中添加血清不能有效地支持小鼠受精卵在体外的发育,添加1 000 IU/ml hLIF能够很好地支持小鼠受精卵的体外发育。     

Roscovitine同期化供核细胞对猴—猪异种核移植胚胎发育的影响

[目的]探讨Roscovitine同期化供核细胞对食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为提高灵长类的核移植效率奠定基础.[方法]活体采集4岁雄性食蟹猴的耳组织,经组织块培养获得纯化的食蟹猴耳成纤维细胞,细胞经固定、染色后用流式细胞仪分析细胞周期分布.以不同同期化方法处理的食蟹猴耳纤维细胞为供体细胞,以体外成熟、去核的猪卵母细胞为受体细胞,利用电融合法构建食蟹猴—猪异种核移植胚胎,观察异种核移植重构胚胎的体外发育情况.[结果]以15 μmol/L Roscovitine处理食蟹猴耳成纤维细胞24、48、72 h获得的G0/G1期细胞比率分别为76.51％、89.69％和90.49％,其中处理48和72h的G0/G1期细胞比率显著高于对照组（P＜0.05）.血清饥饿、接触抑制72 h同期化获得的G0/G1期细胞比率分别为91.12％和90.46％.Roscovitine同期化处理食蟹猴耳成纤维细胞48 h可有效提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率（15.05％）,显著高于血清饥饿同期化处理和接触抑制同期化处理的效果（P＜0.05）.[结论]Roscovitine可有效同期化食蟹猴耳成纤维细胞在G0/G1期,最终提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率.     

长春花碱在牛体外受精胚中染色体标本处理及性别分析

长春花碱是一种常用的细胞分裂阻止剂,在细胞遗传学分析及体外受精胚的性别鉴定等方面有着重要意义.该研究对牛体外受精胚的第一卵裂期染色体标本制作及性比进行了分析.废弃牛卵巢内卵子经体外成熟培养,体外受精20h后,在培养基中添加100ng/ml长春花碱处理8h或10h.结果表明,用长春花碱处理8h的胚胎标本大部分含有可分析的中期分裂像并可进行性别判断,明显高于10h处理的胚胎标本(P<0.05).性比分析表明,牛体外受精的胚胎的雄性发生率略高于雌性发生率.     

激素对小鼠胚胎体外发育的影响

探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。     

活性氧(ROS)对小鼠胚胎分裂指数的影响

小鼠体内发育的桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚和从1-细胞期取出在CZB培养液中培养的桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚的分裂指数分别为5．85，4．64，2．16，4．96和6．25，508，2．77，3．03．经统计分析，体内与体外CZB培养的胚胎分裂指数无显著差异，说明体内发育的胚胎和体外CZB培养胚胎的有丝分裂增殖能力没有差异．体外CZB培养的不同时期添加H2O2的胚胎，发育至桑椹胚、早期囊胚、扩张囊胚阶段，制作胚胎标本，胚胎的分裂指数显示：扩张囊胚的0～72h组的分裂指数与0～12h，24～36h组有显著差异（P〈0．05），而与其它各发育阶段的各组分裂指数均无差异，说明经H2O2处理之后存活下来的胚胎与正常体外发育胚胎的有丝分裂增殖能力没有差异．     

五指山小型猪不同时间采集原核胚的效果研究

本试验拟探索出采集五指山小型猪原核胚的最佳时间．结果表明，五指山小型猪供体母猪，在注射HCG后33～34h手术冲卵是最为理想时间，所得胚胎100％为原核胚．注射HCG后52～58h手术采卵，原核胚所占比例为63．6％．注射HCG后62～72h采卵，原核胚下降比例更大，只有19．1％．     

猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕初期的猪输卵管上皮细胞可促进与之体外共培养的小鼠早期胚胎的发育;随着早期小鼠转基因胚胎的发育,PCR检测呈阳性的转基因胚胎的比率逐渐降低。     

猪胚胎细胞核移植重组胚发育能力的研究

选用香猪2-～16-细胞期卵裂球作核供体,上海白猪卵母细胞作核受体.通过显微操作和电融合技术构成重组胚.体外培养时,以融合前1h激活、融合前2h激活及融合前不激活的卵母细胞作核受体的重组胚,发育率分别为65.8%,53.1%,33.3%.以体内、体外成熟卵母细胞作核受体胞质时,其重组胚的发育能力无显著变化(P＞0.05).作为核供体的胚胎对于重组胚的发育能力有显著影响,母体合子转变以后的胚胎作为核供体时,重组胚的发育能力下降;分别以不同细胞期胚胎(2-,4-,8-和16-细胞)的卵裂球作为核供体的NT胚发育率有显著差异(P＜0.05),以2-～4-细胞胚胎卵裂球作核供体最合适.     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

性控冻精在肉羊胚胎移植中应用效果的研究

为进一步研究肉羊性控精液在胚胎生产上的应用,以萨福克、无角陶赛特纯种肉用绵羊为供体,本地小尾寒羊杂交后代和湖羊为受体,利用子宫角深部输精及一般人工授精等辅助生殖技术使用性控冻精与普通鲜精对两品种肉羊进行人工授精,统计不同品种肉羊的受胎率和可用胚数,对获得的性控胚胎和普通胚胎进行移植,并对比其移植效果。结果表明:萨福克肉羊和无角陶赛特肉羊超排后黄体数差异不明显(P>0.05);普通精液输精所获得的胚胎数极显著高于性控冻精(P<0.01);在受胎率上也做了比较,但差异不显著,受胎率43.2%。由于精液在通过流式细胞仪时,对精子顶体造成一定损伤,因此,无论是子宫角输精或阴道子宫颈输精均影响受精率,但性控精液的推广应用确实可以加速家畜遗传育种速度,缩短育种周期。鉴于此,今后对性控精液的研究重点应该放在精液分离过程中对精子的保护,以减少对精子的损伤。     

牛未成熟卵母细胞体外受精及染色体分析

收集不同供体牛的卵母细胞并分成两组。体外成熟培养16h为不完全成熟组；体外成熟培养24h为完全成熟组。结果显示，体外受精48h后，成熟组大部分胚胎发育到8细胞期和16细胞期，不完全成熟组的多数胚胎发育到2细胞期和4细胞期。染色体异常发生率显著高于成熟组。染色体异常表现为单倍体、多倍体和混合倍体。引起染色体异常发生的原因可能是由于精子穿入时透明带或卵母细胞膜的功能障碍所引起。     

A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield

A cell-free translation system has been constructed that uses a continuous flow of the feeding buffer [including amino acids, adenosine triphosphate (ATP), and guanosine triphosphate (GTP)] through the reaction mixture and a continuous removal of a polypeptide product. Both prokaryotic (Escherichia coli) and eukaryotic (wheat embryos, Triticum sp.) versions of the system have been tested. In both cases the system has proven active for long times, synthesizing polypeptides at a high constant rate for tens of hours. With the use of MS2 phage RNA or brome mosaic virus RNA 4 as templates, 100 copies of viral coat proteins per RNA were synthesized for 20 hours in the prokaryotic or eukaryotic system, respectively. With synthetic calcitonin messenger RNA, 150 to 300 copies of calcitonin polypeptide were produced per messenger RNA in both types of continuous translation systems for 40 hours.     

河南大尾寒羊超数排卵研究

对30只河南大尾寒羊进行超数排卵处理,研究不同激素、不同季节、不同输精方式以及重复超数排卵对其超数排卵效果的影响。结果表明:采用加拿大产FSH处理,河南大尾寒羊的只均黄体数(15.76)和只均获胚数(12.76)显著高于采用新西兰产FSH组(11.78、8.78);冬季处理的河南大尾寒羊的只均黄体数(18.11)、只均获胚数(14.84)和只均可用胚数(5.21)显著高于春季(13.44、9.44、3.78)和秋季处理组(11.61、9.56、2.72);采用350 mg/只剂量FSH处理,河南大尾寒羊只均黄体数(18.27)和只均胚胎数(14.53)显著高于300 mg/只剂量组(12.23、10.23),且优于400mg/只剂量组;腹腔内子宫角输精,河南大尾寒羊只均可用胚数(4.68)显著高于阴道输精处理(1.89);重复超数排卵各次之间的只均黄体数、只均胚胎数和只均可用胚数差异不显著。     

FCS和BSA对小鼠早期胚胎体外培养的影响

本实验是在CZB和Whitten’s Medium 2种培养液中添加胎牛血清(FCS)和牛血清白蛋白(BSA),比较它们对小白鼠早期胚胎体外发育的影响。结果如下:在培养注射HCG后37～39h的小鼠胚胎时,添加FCS的CZB培养液中通过发育阻断期的胚胎和发育到囊胚的胚胎均明显高于添加BSA的CZB培养液(80.9%、64.3%和41.7%、29.6%),差异显著(P0.05);当用上述液培养注射HCG后44h的小鼠胚胎时,不管是进口培养皿还是国产培养皿,胚胎发育率的差异均不显著(P0.05);在用CZB和Whitten’s培养液分别添加FCS和BSA后,培养注射HCG后44h2-细胞小鼠胚胎时,不论添加FCS还是BSA,在CZB培养液中胚胎发育率均高于Whitten’s培养液(P0.05),但添加FCS和BSA之间的差异不显著(P0.05)。     

弓形虫AMA1蛋白的原核表达载体的构建及体外表达

[目的]构建截短型AMA1的原核表达载体,并进行体外诱导表达,为在体外表达弓形虫AMA1重组蛋白。[方法]设计去掉弓形虫AMA1信号肽的PCR引物,以弓形虫cDNA为模板进行PCR扩增,PCR扩增产物酶切后与pGEX-4T-3原核表达载体连接,并转化到BL21感受态细胞内。对经PCR鉴定为阳性的重组质粒pGEX-4T-3-AMA1进行体外诱导表达。[结果]成功构建了弓形虫AMA1的原核表达质粒pGEX-4T-3-AMA1,通过体外诱导表明,AMA1融合蛋白是以包涵体的形式存在。[结论]弓形虫AMA1蛋白的体外表达为进一步制备抗AMA1血清及免疫学实验奠定了基础。     

小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究

为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响,分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。结果表明:子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P0.01),而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P0.05),两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P0.05),说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著,且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。小鼠早期胚胎发育观察结果表明:超排处理后,在公母鼠合笼后76~79.5 h采胚,胚胎大多处于桑椹胚期,而在公母鼠合笼后88~91.5 h采胚,胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期;采用TCM199+15%胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。     

水牛胚胎体外生产研究综述

近年来采用其它家畜上的程序来进行水牛体外胚胎生产(invitroproduction,IVP)引起了越来越多的关注。水牛胚胎体外生产已获得了较高的卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率,但囊胚发育率和体外胚的移植成功率仍较低,水牛IVP胚胎体外生产效率比黄牛低得多。在IVP技术应用于水牛生产育种之前,还有一些问题必须解决。笔者对水牛胚胎体外生产的不同技术,包括未成熟卵母细胞的体外培养成熟和受精以及胚胎体外培养卵裂发育至囊胚等进行综述。还讨论了胚胎体外生产存在的问题及可能的解决方案。