佛手瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

[目的]克隆佛手瓜鲨烯合酶(SQS)基因,并基于克隆的SQS序列分析该酶的分子结构,为佛手瓜生物活性成分的利用提供理论依据。[方法]根据SQS基因5'末端保守序列和3'race方法扩增的佛手瓜SQS基因3'末端序列设计佛手瓜SQS基因克隆引物。扩增的佛手瓜SQS基因片段插入p GEM-T Easy Vector后经DNA测序。应用生物信息学方法分析克隆序列的开放阅读框架(ORF)、酶蛋白的疏水性/亲水性和蛋白质磷酸化位点,预测酶蛋白的二级结构、结构域、三级结构和跨膜区。以布朗葡萄藻为outgroup,应用MEGA 5.0进行UPGMA算法构建系统树,并进行1 000次的Bootstrap测试。[结果]佛手瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为6.983。构象预测提示该酶二级结构以α螺旋为主,是一种只有三级结构的单体酶,其活性中心是主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构,酶蛋白肽链中具有1个跨膜区。结构域分析表明SQS属于异戊二烯合酶家族。磷酸化位点分析显示该酶共有17个磷酸化位点,其中,S48位于与酶活性中心相关模体中,而S196为陆生植物SQS基因的正选择位点。以佛手瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树得到的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。[结论]佛手瓜SQS是由417氨基酸残基构成的单体酶,具有1个跨膜区和17个磷酸化位点,其中,S48和S196可能是佛手瓜SQS酶活性调节的关键性磷酸化位点。     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶生理功能分析

为了研究金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶的功能和作用,克隆该基因的全长序列,在一氧化氮合酶基因缺陷菌株的基础上,构建一氧化氮合酶过表达菌株,进行表型验证,研究NO对细菌表型的影响。结果显示:一氧化氮合酶缺失使细菌自溶速率加快,抗氧化杀伤能力减弱,生物被膜生成能力降低、缺失和过表达均会影响细菌正常的生长周期和速率。外源性NO对野生菌株、敲除菌株和过表达菌株生物被膜有不同影响显示,金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶还参与了外源性NO对生物被膜的调控。一系列表型结果表明:金黄色葡萄球菌内源性NO作用不仅仅阻断Fenton反应、增强过氧化氢酶活性,还可以作为一种信号分子调控细菌基因的转录和表达。     

葡萄鲨烯合成酶基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了葡萄鲨烯合成酶基因(SQS)的全长cDNA(1595 bp)。序列分析结果表明:该基因包含1个完整的1242 bp开放阅读框,编码413个氨基酸残基;葡萄SQS与三七(Panax notoginseng)、人参(Panaxginseng)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)的SQS分别有84%、83%、84%的一致性。     

人参SQS和SE酶基因的克隆及其表达载体的构建

鲨烯合酶(SQS)和鲨烯环氧酶(SE)是人参皂苷生物合成过程中的关键酶。以五年生人参叶片为供试材料提取总RNA,根据GeneBank上已发布的SQS和SE基因登录号(AB010148和AB122078),查找对应序列并设计特异性引物,运用RT-PCR方法,通过构建pMD18-T重组质粒、测序分析,成功克隆到大小分别为1440bp的SQS基因和1780bp的SE基因。同时还构建了这2个基因的表达载体pCAMBIA1301-SQS和pCAMBIA1301-SE,从而为分子水平上探讨三萜皂苷生物合成机理及其在药用植物中的应用提供试验材料。     

Structural insight into the transglycosylation step of bacterial cell-wall biosynthesis

Peptidoglycan glycosyltransferases (GTs) catalyze the polymerization step of cell-wall biosynthesis, are membrane-bound, and are highly conserved across all bacteria. Long considered the "holy grail" of antibiotic research, they represent an essential and easily accessible drug target for antibiotic-resistant bacteria, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus. We have determined the 2.8 angstrom structure of a bifunctional cell-wall cross-linking enzyme, including its transpeptidase and GT domains, both unliganded and complexed with the substrate analog moenomycin. The peptidoglycan GTs adopt a fold distinct from those of other GT classes. The structures give insight into critical features of the catalytic mechanism and key interactions required for enzyme inhibition.     

一种光敏杀菌型洗涤剂的研制

以光敏剂竹红菌素作为杀菌剂,用直链烷基苯磺酸盐(LAS)、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠(AES)、椰子油二乙醇酰胺(6501)及其他助剂复配光敏杀菌型洗涤剂。采用均匀设计对洗涤剂中3种表面活性剂(LAS、AES和6501)的配比进行优化,采用悬液定量杀菌法测试洗涤剂在不同稀释度和光照处理时间下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值。结果表明,表面活性剂的最佳配比为LAS15.5%,AES 4.5%,6501 3.5%。光敏洗涤剂在1∶10稀释度下光照处理3 min或1∶100稀释度下光照处理5 min以上对金黄色葡萄球菌的杀灭对数值KL≥5.00;在所有处理条件下该洗涤剂对大肠杆菌的杀灭对数值均小于5.00。     

A nitric oxide-inducible lactate dehydrogenase enables Staphylococcus aureus to resist innate immunity

Staphylococcus aureus is one of the most successful human pathogens, colonizing 2 billion individuals worldwide and causing invasive infections even in immunocompetent hosts. S. aureus can evade multiple components of host innate immunity, including the antimicrobial radical nitric oxide (NO.) produced by activated phagocytes. We show that S. aureus is capable of metabolically adapting to nitrosative stress by expressing an NO.-inducible L-lactate dehydrogenase (ldh1, SACOL0222) divergently transcribed from the NO.-detoxifying flavohemoglobin (hmp). L-Lactate production allows S. aureus to maintain redox homeostasis during nitrosative stress and is essential for virulence. NO.-inducible lactate dehydrogenase activity and NO. resistance distinguish S. aureus from the closely related commensal species S. epidermidis and S. saprophyticus.     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.     

消毒威对几种菌株的杀灭效果研究

为了检测消毒威消毒剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌和沙门氏菌的杀灭效果．通过采用悬液定量杀菌法对几种标准菌株进行杀灭效果观察。发现20mg／L的消毒威作用5min．对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌可达到全部杀灭作用,对沙门氏菌可达到消毒效能,对巴氏杆菌需适当加大浓度。以此笔者认为消毒威对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及巴氏杆菌均具有快速强效杀灭作用,适用于畜禽舍内外环境的消毒。     

Crystal structure of inhibitor-bound human 5-lipoxygenase-activating protein

Leukotrienes are proinflammatory products of arachidonic acid oxidation by 5-lipoxygenase that have been shown to be involved in respiratory and cardiovascular diseases. The integral membrane protein FLAP is essential for leukotriene biosynthesis. We describe the x-ray crystal structures of human FLAP in complex with two leukotriene biosynthesis inhibitors at 4.0 and 4.2 angstrom resolution, respectively. The structures show that inhibitors bind in membrane-embedded pockets of FLAP, which suggests how these inhibitors prevent arachidonic acid from binding to FLAP and subsequently being transferred to 5-lipoxygenase, thereby preventing leukotriene biosynthesis. This structural information provides a platform for the development of therapeutics for respiratory and cardiovascular diseases.     

野菊花提取物抑菌活性

利用琼脂扩散法和琼脂平板稀释法分别测定野菊花提取物对供试菌的抑菌活性和最小抑菌浓度MIC(Minimal inhibitory concentration)。通过测定不同培养时间后培养液的OD560值。活菌数和电导率研究野菊花提取物对金黄色葡萄球菌的生长曲线的影响。结果表明,野菊花提取物原液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性分别为(27.02±0.45)mm、(20.56±0.43)mm、(17.82±0.36)mm,MIC分别为原液浓度的12.5%(v/v)、25%(v/v)、50%(v/v)。与对照组相比,野菊花提取物作用于金黄色葡萄球菌后,菌体的生长繁殖受到影响,细胞渗透性改变,而且作用方式与麦迪霉素对金黄色葡萄球菌的作用方式存在差异。     

Structural mechanism for statin inhibition of HMG-CoA reductase

HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A) reductase (HMGR) catalyzes the committed step in cholesterol biosynthesis. Statins are HMGR inhibitors with inhibition constant values in the nanomolar range that effectively lower serum cholesterol levels and are widely prescribed in the treatment of hypercholesterolemia. We have determined structures of the catalytic portion of human HMGR complexed with six different statins. The statins occupy a portion of the binding site of HMG-CoA, thus blocking access of this substrate to the active site. Near the carboxyl terminus of HMGR, several catalytically relevant residues are disordered in the enzyme-statin complexes. If these residues were not flexible, they would sterically hinder statin binding.     

医用臭氧对腹水中大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用

目的观察医用臭氧对腹水中细菌的杀菌作用。方法抽取4例肝硬化患者的无菌腹水,加入大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌培养24 h后,通入浓度为80 mg/L医用臭氧作用不同时间,采用悬液定量法、活菌计数观察杀菌效果。结果医用臭氧对不同腹水中大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌杀菌效果的差异均有统计学意义（P〈0.01）,且杀菌效果随作用时间延长而增加（P〈0.01）。结论 80 mg/L医用臭氧的杀菌效果随腹水中总蛋白含量降低及作用时间延长而增加。     

刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。     

甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究

【目的】在昆虫中,几丁质的合成对于其生长发育至关重要,虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比较深入,但是在昆虫中,目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面,而对于通路上其他基因的研究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP）对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。【方法】以甜菜夜蛾5龄第1天幼虫的cDNA为模板,通过简并引物扩增出甜菜夜蛾UAP基因（SeUAP）的中间片段,然后利用特异性引物和RACE技术扩增出3′和5′ race序列,拼接得到cDNA全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA,并通过RT-PCR方法分析SeUAP在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射dsUAP观察其生长状况,检测RNAi的效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp的SeUAP cDNA,编码一个491个氨基酸残基的蛋白,与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的UAP亲缘关系较近。该基因在表皮和卵巢中大量表达,在气管和中肠中的表达次之,在马氏管中表达微弱,在脂肪体中则基本检测不到其转录本的存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达,在卵的整个阶段、L22（幼虫2龄第2天）、L31、L42、L51、P0、P5、P7以及A3这些天中的表达量较高,其余天数表达量较低,其表达的高峰主要出现在几丁质需求量较高的时期。RNAi结果表明,通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射5 µg dsRNA,导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡,并出现两种畸形现象：（1）虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化,但头部蛹壳形成有障碍,化蛹时无法突破旧表皮;（2）虫体头部蛹壳形成正常,也能正常突破旧表皮,但蜕皮过程仅到此为止,无法正常进行下去。定量PCR结果显示SeUAP的沉默对几丁质合成酶A基因（SeCHSA）下调不明显,而对几丁质合成酶B（SeCHSB）的表达有明显下调作用。【结论】UAP可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一定作用。     

羊耳菊提取物的抑菌动力学研究

[目的]研究羊耳菊不同浓度提取物对细菌存活率随时间变化的关系,以及不同pH值条件下提取物的抑菌效果。[方法]以金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌为供试菌种,绘制时间杀菌曲线和浓度杀菌曲线。在提取物浓度为最低抑菌浓度（MIC）时培养24h,测定不同pH值条件下的抑菌率。[结果]羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌和甲型副伤寒沙门氏菌的MIC、最低杀菌浓度（MBC）分别为62.5、125.0mg/ml和125.0、250.0mg/ml。绘制了羊耳菊提取物16MIC、4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC和对照条件下的杀菌曲线。羊耳菊水提物抑菌作用最适pH值为6～8。[结论]羊耳菊提取物对金黄色葡萄球菌的杀菌作用在较高浓度时并没有进一步提高杀菌速度,表现为时间依赖性,但对甲型副伤寒沙门氏菌表现为浓度性依赖性。     

金黄色葡萄球菌TRAP基因的克隆与序列分析

参考Genbank已经发表的关于金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的基因序列,设计合成1对引物,从本实验室保存的金黄色葡萄球菌Newman株中提取细菌DNA,对TRAP蛋白基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现1条约500bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,进行核苷酸序列分析,然后与报道的TRAP蛋白基因进行比较。结果表明:所扩增的基因序列与报道的TRAP核苷酸的同源性高达100/,证实为金黄色葡萄球菌Newman株TRAP蛋白基因。     

一个金黄色葡萄球菌蛋白磷酸酯酶基因的克隆表达及酶活性测定

金黄色葡萄球菌是一种引起人畜多种感染的主要病原菌,开发治疗金黄色葡萄球菌感染的新药途径之一是药物寻靶。研究克隆了一个金黄色葡萄球菌基因,并进行了蛋白诱导表达和酶活性测定。结果表明,该基因编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶活性。实验结果为进一步挖掘该蛋白作为药物靶标的潜在功能奠定了基础。     

蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究

目的:研究蝎子草醇提浸膏(Girardinia suborbiculata C.J.Chen ethanol extract,GSEE)对金黄色葡萄球菌的抗菌机制.方法:测定蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC),通过GSEE对菌体生长曲线、菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸合成等的影响来对GSEE的抗菌机制进行研究.结果:GSEE对金黄色葡萄球菌的MIC为100 mg/mL,可明显抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂;SDS-PAGE电泳表明,金黄色葡萄球菌的可溶性蛋白含量在GSEE作用后的条带明显少于对照组;同时,通过DAPI染色显示,GSEE对菌体的核酸合成具有显著抑制作用.结论:GSEE对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌作用,其抗菌机制可能通过抑制菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸的合成等方面来实现抑制金黄色葡萄球菌的生长.     

异黄酮的生物合成途径及其调控

异黄酮是一类次级代谢产物,大多存在于豆科植物中,是苯丙烷类代谢途径的一个分支。异黄酮生物合成的关键酶包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、异黄酮合酶(IFS),能够在转录和转录后水平对异黄酮的生物合成进行调控,在转录水平上诱导它的生物合成的因素包括代谢工程的方法、光照、昼夜规则、茉莉酮化合物等。在豆科植物中提高异黄酮的产量和在非豆科植物中产生异黄酮将对农业和食品业产生重大的影响。