盐碱池塘养殖鲤肠道菌群的分子分析

为了了解盐碱池塘养殖鲤肠道细菌群落组成及多样性,提取鲤(Cyprinus carpio L.)肠道细菌基因组DNA,选用细菌通用引物对16S rRNA基因进行了PCR扩增,构建了细菌16S rRNA基因克隆文库。通过对阳性克隆子进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),选出有代表性的克隆子进行测序、BLAST比对分析和构建系统发育树。本研究从16S rRNA基因文库中共筛选出176个阳性克隆,经RFLP分析得到28个不同分类操作单元(operational taxonomic unite,OTU)(GenBank登录号:JX262557~JX262584),文库覆盖度为88.6%。16S rRNA序列系统发育分析发现,盐碱塘养殖鲤肠道细菌归属于变形细菌门(Proteobacteria)(包含Alpha和Gamma亚群)、厚壁细菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)4个门,分别占克隆总数的89.9%、7.9%、1.1%和1.1%。其中,变形细菌门的α-变形菌纲(占克隆总数的88.1%)为优势类群,气单胞菌属为优势菌属。本研究揭示了盐碱池塘养殖条件下健康鲤肠道细菌群落组成。     

模拟干湿交替对水稻土古菌群落结构的影响

干湿交替是自然界普遍存在的现象,但长期以来由于技术的限制,复杂土壤中微生物对水分变化的响应规律仍不清楚。针对我国江苏常熟湖泊底泥发育的典型水稻土,在室内开展湿润-风干以及风干-湿润各三次循环,每次循环中湿润、风干状态各维持7d,利用微生物核糖体rRNA的通用引物进行PCR扩增,通过高通量测序分析土壤古菌多样性变化,同时结合实时荧光定量PCR技术,在DNA和RNA水平研究古菌数量对干湿交替过程的响应规律。结果表明:水稻土湿润-风干过程中,在DNA水平土壤古菌数量降幅约为149倍~468倍,而在RNA水平降幅最高仅为2.06倍;水稻土风干-湿润过程中,在DNA水平古菌数量增幅在147倍~360倍之间,而在RNA水平增幅最高仅为2.95倍。表明在干湿交替过程中,DNA水平的古菌16S rRNA基因数量变化远高于RNA水平。基于高通量测序多样性的结果表明,在DNA和RNA水平,湿润土壤3次风干、以及风干土壤3次加水湿润7d恢复后,土壤古菌群落结构均发生统计显著性改变。在微生物门、纲、目、科和属的不同分类水平下,水稻土古菌主要包括3、10、13、14、10种不同的类群,在RNA和DNA水平的结果基本一致。干湿交替导致部分古菌类群发生显著变化,其中在微生物分类学目水平发生显著变化的古菌最高达到6种,主要包括产甲烷古菌和氨氧化古菌,如Methanobacteriales、Methanosarcinales、Methanomicrobiales和Nitrososphaerales等。这些研究结果表明,反复的干湿交替并未显著改变水稻土中古菌的主要类群组成,古菌类群的绝对数量和相对丰度发生了一定程度的变化,但这些变化与微生物生理作用的联系仍需进一步研究;风干土壤中古菌RNA序列极可能来自于完整的古菌细胞,暗示了这些古菌细胞能够较好地适应水稻土中水分的剧烈变化,风干状态的土壤在一定程度也可用于土壤古菌群落组成研究。     

基于线粒体COⅠ及Cyt b基因的7种龙虾类分子系统关系

运用PCR法扩增湛江沿海海域7种龙虾的线粒体COⅠ和Cytb基因并对其序列进行分析,以分析7种龙虾的分子系统关系。从7种龙虾中扩增到的COⅠ基因片段长度均为650bp,共存在224个核苷酸位点变异,变异率为35.22%,简约信息位点161个;扩增到的Cytb基因片段长度均为536bp,共存在148个核苷酸位点变异,变异率为29.48%,简约信息位点66个。所有的扩增序列中,没有发现碱基的缺失以及插入,序列中的转换大于颠换,且碱基替换多发生于密码子的第3位。以帝加洛真龙虾（Palinurus delagoae）、普通真龙虾（Palinurus elephas）、吉氏真龙虾（Palinurus gilchristi）为外群,对COⅠ和Cytb两个基因序列采用最大简约法（maximum parsimony,MP）和贝叶斯推论法（bayesian inference,BI）构建龙虾类分子系统树。结果显示：日本龙虾和密毛龙虾亲缘关系比较近,而其它5种龙虾与真龙虾属的3种关系较近,与传统的分类存在一定分歧。     

西藏牦牛mtDNA 16S rRNA基因的克隆及其遗传多样性分析

本研究首次通过克隆、测序获得了11个西藏牦牛类群共111头个体的mtDNA 16S rRNA基因全序列,并分析了西藏牦牛的遗传多样性、分类关系、起源和分化,为进一步保护和合理利用西藏牦牛遗传资源以及探讨牦牛类群的划分提供分子依据。结果表明：西藏牦牛16S rRNA基因全序列长度为1571 bp或1570 bp（LWQ4）;G＋C平均含量37.8%,具有明显的碱基偏倚性;平均核苷酸多样性（Pi）为0.00291,平均单倍型多样性（Hd）为0.8501±0.0009,111个样本共发现48种单倍型并聚为2簇,表明西藏牦牛具有较高的遗传多样性并存在2个母系起源;Kimura双参数遗传距离范围为0.00098-0.00694,11个西藏牦牛类群划分为2大类：嘉黎牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、工布江达牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛、康布牦牛、桑桑牦牛、江达牦牛、桑日牦牛为一类,类乌齐牦牛单独为一类。本研究发现类乌齐牦牛具有较丰富的遗传多样性,并且发现了一个序列特异个体LWQ4,需要对其进行更深入的研究。牛种间的聚类结果显示,西藏牦牛与美洲野牛的亲缘关系最近,与普通牛、水牛的亲缘关系相对较远,本研究支持将牦牛从牛属（Bos taurus）中分离出来,作为一个独立的牦牛属（Poephagus）的观点。     

16S rRNA基因高通量测序分析牛粪发酵细菌多样性

将养殖粪便进行资源化处理,尤其是将粪便堆肥发酵后变为生物肥料还田,具有重要的经济、社会和生态效益。之前关于细菌在堆肥过程中的研究,大部分采用实验室培养、分离、鉴定的方法,由于受培养方式的限制,仅能分析粪肥中有限的细菌类别。16S r RNA基因作为生物物种的特征核酸序列,被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定研究的指标。本研究使用16S r RNA基因高通量测序技术,分析了牛粪自然发酵与添加益生菌剂发酵过程中细菌种群的多样性变化。结果表明,1)新鲜牛粪、自然发酵1个月、自然发酵6个月的牛粪中细菌种群并没有明显的变化规律,说明自然发酵过程主要依赖于新鲜牛粪中携带的细菌种群;2)添加益生菌发酵后,细菌种群明显不同于不自然发酵过程中的细菌种群,其中变形菌门(Proteobacteria)细菌显著增加,而厚壁菌门(Firmicutes)细菌显著减少,说明益生菌剂能够显著改变堆肥过程中的细菌种群。本研究对于理解牛粪堆肥过程、提高堆肥效果,以及新型堆肥益生菌剂的开发都具有重要意义。     

巢式PCR检测无乳链球菌16SrRNA方法的建立及应用

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）引起的奶牛乳房炎主要表现为隐性型,需要通过实验室检查才能确诊。研究建立了一种特异、敏感和快速的巢式PCR方法用于检测奶样中的无乳链球菌。利用链球菌属（Sgeptococcus）16S rRNA基因的保守区设计通用引物作为链球菌属的阳性控制,在保守区内的可变区设计无乳链球菌特异的引物。研究结果表明,通过奶样中无乳链球菌的增菌培养,简便、快速提取DNA和特异性PCR反应,可以检测到奶样中1CFU／mL的无乳链球菌,可以用作牛群中无乳链球菌感染的早期流行病学调查。     

不同农田生境对通俗腔蚓肠道菌群结构的影响

【目的】蚯蚓肠道微生物种类繁多,其中细菌群落对蚯蚓适应不同的生境具有重要作用,而关于蚯蚓肠道菌群的研究多集中于养殖型蚯蚓,野生蚯蚓的研究相对缺乏。【方法】为解析不同生境野生蚯蚓肠道的菌群差异,本研究采集河北省沧州市农林科学院试验田中的黄瓜地和辣椒地的通俗腔蚓（Metaphire vulgaris）,并通过高通量测序对其肠道细菌群落进行了分析。提取蚯蚓肠道微生物总DNA,特异性扩增16S rRNA基因的V3-V4区,利用Illumina Hiseq 2500测序平台进行双端测序,然后对OTU(operational taxonomic unit)归类,并进行物种组成分析、Alpha和Beta多样性分析、样品组间统计分析。【结果】蚯蚓肠道分离土样中CZM（采自辣椒地的蚯蚓）和CZH（采自黄瓜地的蚯蚓）相对丰度大于1%的优势菌属分别为12和13个,肠道细菌中门水平相对丰度最高的是变形菌（Proteobacteria）。同时,还发现一些未分类的细菌,CZH肠道菌群中未分类的细菌较多,且CZH肠道细菌多样性指数也高于CZM。此外,CZH和CZM肠道细菌中丰富度位于前30且有属类分析的OTU代表性...     

基于16SrRNA序列分析红耳龟肠道拟杆菌和厚壁杆菌菌群多样性

脊椎动物肠道内定植了大量的微生物群落,在正常肠道菌群中,拟杆菌菌群和厚壁杆菌菌群作为优势菌群存在,对宿主的生理健康起着重要的作用。为了更好地了解外来入侵物种红耳龟的肠道拟杆菌和厚壁杆菌菌群多样性组成,本研究提取3只成体红耳龟粪便的宏基因组DNA,利用最新的Roche454测序技术对样本菌群的16SrRNA基因V3～V5区域进行测序。测序结果显示拟杆菌菌群为2纲5科11属,其中拟杆菌纲（98．82±1．24）％是绝对优势菌群;厚壁杆菌菌群被鉴定为3纲11科38属,主要由梭菌纲（95．81±0．88）％构成。此外,测序还检测到大量未知的拟杆菌类群（4．38±1．64）％和厚壁杆菌类群（14．96±8．15）％。本研究表明成体红耳龟粪便中拟杆菌菌群和厚壁杆菌菌群具有多样性。基于16SrRNA基因的Roche454测序分析可以很好地揭示肠道菌群的组成结构。     

10个山羊品种线粒体DNA的遗传多态性

用PCR-SSCP分析了10个山羊（Capra hircus）品种的线粒体DNA编码区变异情况,这些品种分别来自我国9个省和自治区,1个国外品种安哥拉山羊,共计465个个体。根据PCR-SSCP的结果挑选出118个个体进行D-loop第1高变区测序,并截取测定序列的481bp进行分析,系统建树显示,10个山羊品种很明显地分成了4个支系A、B、C和D。对所有样本进行分子差异等级分析（AMOVA）,品种内的方差组分占77.77%,表明10个山羊品种间没有出现显著的遗传分化,品种间表现弱的遗传结构。对118条序列进行歧点分布分析表明,整个山羊群体曾经历过2次群体扩张事件。     

芦苇定居后铜尾矿细菌群落结构的变化

Soil samples were collected from both bare and vegetated mine tailings to study the changes in bacterial communities and soil chemical properties of copper mine tailings due to reed (Phragmites communis) colonization. The structures of bacterial communities were investigated using culture-independent 16S rRNA gene sequencing method. The bacterial diversity in the bare mine tailing was lower than that of the vegetated mine tailing. The former was dominated by sulfur metabolizing bacteria, whereas the latter was by nitrogen fixing bacteria. The bare mine tailing was acidic (pH = 3.78), whereas the vegetated mine tailing was near neutral (pH = 7.28). The contents of organic matter, total nitrogen, and ammonium acetate-extractable potassium in vegetated mine tailings were significantly higher than those in the bare mine tailings (P < 0.01), whereas available phosphorus and electrical conductivity were significantly lower than those in the bare mine tailings (P < 0.01). The results demonstrated that 16S rRNA gene sequencing could be successfully used to study the bacterial diversity in mine tailings. The colonization of the mine tailings by reed significantly changed the bacterial community and the chemical properties of tailings. The complex interactions between bacteria and plants deserve further investigation.     

利用mtDNA D-loop区研究中国10个绵羊品种的遗传多样性与起源

中国家绵羊的起源目前还不清楚,存在双起源说和三起源说,争论较大。为了进一步研究绵羊的起源和遗传多样性,根据已知家养绵羊(Ovis aries)线粒体基因组序列,利用 Primier premier5.0 设计引物,对我国 10 个家养绵羊品种 133 只个体的 mtDNA D-loop 区进行测序并利用 Laser Gene、MEGA4、Clustalx1.83 等软件对结果进行分析 ,结果标明,整个 D-loop 区为 1 106~1 182 bp,共检测到 103 种单倍型,155 个多态位点,表明我国家养绵羊品种遗传多样性丰富。通过构建 NJ 网络进化树,得出中国家养绵羊分为两个分支,羱羊(O. ammon)(AJ238300)与盘羊(O. vignei)(AY091490)聚为一类,而摩佛伦羊(O.musmon)(AY091487)与一个分支聚为另一类。说明,摩佛伦羊对中国家养绵羊起源与进化的贡献更大。本研究所测定的中国家养 10 个品种分为 A、B 两大支系表明家养绵羊至少有两大母系起源,且单倍型以亚洲 A 型为主。本研究从物种水平上评价了我国家养绵羊品种的遗传多样性,指出了中国家养绵羊分为两个分支,为确立中国家养绵羊种群关系和保护种质资源提供了理论依据。     

罗非鱼选育群体Cytb与D-loop序列变异信息对比分析

对罗非鱼选育群体mtDNA Cytb和D-loop序列遗传变异开展对比研究,根据2种方法得到的多态位点比率平均为0.776 74单倍型多样度比率平均为0.919 45核苷酸多样性指数比率平均为0.769 77平均核苷酸差异数比率均值为0.936 19Cytb序列碱基转换率平均0.042 67Cytb碱基颠换率平均0.004 10D-loop序列碱基转换率平均0.037 25D-loop碱基颠换率平均0.022 84。该结果对比揭示了Cytb和D-loop序列分析中的差异,为类似研究提供参考。     

Genetic diversity of Rhizobium present in nodules of Phaseolus vulgaris L. cultivated in two soils of the central region in Chile

Although Phaseolus vulgaris L. is native from the Americas and is currently cultured in diverse areas, very little is known about the diversity of symbiotic nitrogen fixing Rhizobium (mycrosymbiont) in many of those cultures. Therefore, the aim of this study was to assess the genetic diversity of Rhizobium present in nodules of P. vulgaris in the central region of Chile. A method to extract DNA from surface-sterilized nodules was applied to two populations of the same seed variety grown in different fields. The 16S rRNA and nifH genes were amplified directly from the DNA extracted. DGGE analysis and clone libraries showed a restricted genetic diversity of the microsymbiotic populations that nodulate P. vulgaris. Both molecular markers revealed the presence of a microsymbiont closely related to Rhizobium etli in all the plants from the soils studied, indicating that the populations of Rhizobium sp. nodulating P. vulgaris in the central region of Chile displayed an extremely low genetic diversity. The level of genetic diversity in microsymbiont populations in plants grown in soils with different origin suggested that other factors rather than the indigenous soil rhizobial populations play a major role in the selection of the symbiotic partner in P. vulgaris.     

四个鲤鱼种群遗传多样性的AFLP分析

本文采用AFLP技术对黑龙江野鲤、黄河鲤、建鲤和荷包红鲤4个鲤鱼种群共96个个体进行了遗传多样性分析。结果显示,8对选择性扩增引物共扩增得到502个位点,其中多态性位点273个,多态性比率为54．38％。同时对4个种群的Shannon多样性指数,Nei’s基因多样性等参数进行了分析,结果表明,4个种群的Shannon多样性指数分别为0．2114±0．2705,0．1825±0．2694,0．1888±0．2587和0．1600±0．2426,Nei’s基因多样性指数分别为0．1398±0．1872,0．1225±0．1863,0．1235±0．1774和0．1036±0．1636;总基因多样性（H4）平均值为0．1721±0．0350;种群内基因多样性（Hs）平均值为0．1224±0．0190;基因分化系数（Gst）为0．2892,种群内的基因多样性占总群体的71．08％,种群间为28．92％,而基因流系数（Nm）为1．2291。另一方面,分子方差分析（AMOVA）结果表明,种群平均近交系数（Fst）为0-31191,变异31．19％来自种群间,68．81％来自种群内。4个种群中黑龙江野鲤的种内多态性比例最高,而荷包红鲤种群最低,并且4个鲤鱼种群当前的种质资源良好,具有一定的种群稳定性;建鲤已经开始分化,与亲本荷包红鲤亲缘关系逐渐分化,逐步形成自己稳定的遗传结构。本研究为探讨鲤鱼种群的遗传特性和遗传分化提供参考,也为其种质资源的保护及合理利用提供科学依据。     

五氯酚厌氧生物降解体系中细菌的多样性分析

为了解五氯酚(PCP)降解过程中参与PCP降解的微生物多样性,本文应用16SrRNA基因克隆文库方法对PCP厌氧生物降解体系中细菌群落的组成和相对丰度进行了研究。结果表明,TM7类群的微生物在整个细菌群落中占有最大丰度(48.6%),检测到的序列与在三氯乙烯污染的地下水中检测的克隆子有一定的序列相似性(93.6%)。丰度位居第二的微生物类群为β-变形菌纲(Betaproteobacteria)细菌,其中的一些克隆子(10.8%)与脱氯微生物Dechlorosoma suillum具有极高的序列同缘性(99.7%)。此外,也检测到少数Clostridium属[厚壁菌门(Firmicutes)类群]的微生物。克隆文库中发现许多序列(占整个克隆文库的51.3%)与Gen Bank中已报道的序列具有较远的同源性(小于93.4%),它们可能代表新的微生物。本研究进一步拓宽了对PCP降解微生物多样性的认识。     

中国荷斯坦牛和鲁西黄牛mtDNA D-loop序列多态性分析

为了从母系遗传角度深入阐明中国荷斯坦牛和鲁西黄牛的群体遗传多样性以及起源进化,本研究采用PCR测序法测定了9头中国荷斯坦牛和11头鲁西黄牛的线粒体DNAD-loop区的部分序列,并经剪切后进行生物信息学软件分析。结果表明,20个个体D-loop区共711bp,共检测到19种单倍型和50个多态位点。核苷酸多样性（Pi）为0.02133±0.00454,单倍型多样性（Hd）为0.994±0.019,平均核苷酸差异数（k）为15.14620。构建的NJ网络进化树共分为两大支系,其中部分鲁西黄牛与瘤牛聚为一支,而中国荷斯坦牛和部分鲁西黄牛与普通黄牛聚为一支。说明中国荷斯坦牛和鲁西黄牛群体遗传多样性均较高;鲁西黄牛同时含有瘤牛和普通黄牛的血统,而中国荷斯坦牛只含有普通黄牛的血统。     

基于线粒体COII-LrRNA基因对肾形肾状线虫种内群体的遗传多样性分析

肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)是一种植物半内寄生线虫,分布于世界的热带和亚热带地区,是许多蔬菜和热带果树重要的病原线虫.为明确该线虫种内群体的遗传变异,本研究采用序列分析法,对采自浙江(ZJ)、福建(FJ)和重庆(CQ)3个地区的肾形肾状线虫的线粒体COII-LrRNA基因序列进行比较.结果表明,肾形肾状线虫线粒体COII-LrRNA基因片段序列为557～563 bp,AT含量为85.5％,明显高于GC含量.序列分析所得3个群体总的变异位点数、单倍型数、单倍型多样性指数(haplotype diversity,Hd)和核苷酸多样性指数(nucleotide diversity,π)分别为176、40、0.946和0.157 4.分子方差分析(analysis of molecular variance,AMOVA)结果显示,这3个肾形肾状线虫群体间遗传分化系数为0.058 15,遗传分化程度中等,没有明显的地理隔离.遗传变异结果显示,94.18％的变异来自群体内个体间,只有5.82％的变异发生在群体间.结果说明,我国肾形肾状线虫种群内COII-LrRNA基因序列变异较明显,具有丰富的遗传多样性,且对环境变化的适应能力较强.研究结果丰富了我国肾形肾状线虫的系统发育信息,为肾形肾状线虫危害植物的内在遗传因素的研究提供了资料.     

Genetic diversity and phylogeny of indigenous rhizobia from cowpea [<Emphasis Type="Italic">Vigna unguiculata</Emphasis> (L.) Walp.]

16S rRNA RFLP, 16S rRNA sequencing, 16S-23S rRNA Intergenetic Spacer (IGS) RFLP and G-C rich random amplified polymorphic DNA (RAPD) assays were conducted to genetically characterise indigenous cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] rhizobia from different geographic regions of China. Isolated cowpea rhizobia comprised six 16S rRNA genospecies. Genotype I was composed of 14 isolated strains and the reference strains of B. japonicum and B. liaoningense. This group was divided into two sub-groups respectively related to B. japonicum and B. liaoningense by 16S rRNA sequencing, IGS restriction fragment length polymorphism and RAPD assays. Genotype II composed of 27 isolates from a variety of geographic regions. Four different assays confirmed this group was genetically distinct from B. japonicum and B. liaoningense and probably represent an uncharacterised species. Strains isolated from Hongan, Central China and B. elkanii were grouped to genotype III. Strain DdE4 was solely clustered into genotype IV and related to Rhizobium leguminosarum. Genotypes V and VI consisted of six fast-growing isolates and clustered with reference strain of Sinorhizobium fredii. Comparing with the miscellaneous slow-growing isolates, fast-growing isolates mainly isolated from cowpea cultivar Egang I exhibited strict microbe–host specificity except SjzZ4. Nucleotide sequences reported were deposited in the GenBank with the accession numbers DQ786795–DQ786804.