绿头鸭线粒体基因组全序列分析及河鸭类系统发育关系

参照近源物种线粒体基因组序列设计引物15对,用PCR产物直接测序法测得绿头鸭线粒体基因组全序列,初步分析其基因组特点和各基因的定位。结果显示：绿头鸭线粒体基因组全长16606bp,共有13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个非编码控制区(D-loop),其组成和排列顺序与已知雁形目鸟类相似。基于GenBank已有D-loop区序列,用N-J法构建河鸭类系统进化树。结果表明：河鸭类分为3个进化枝。其中,家鸭、绿头鸭及斑嘴鸭构成一枝 ,初步推断我国家鸭起源于绿头鸭和斑嘴鸭,或是绿头鸭和斑嘴鸭的杂交后代。     

石首鱼科海洋鱼类DNA条形码的构建

为筛选石首科鱼类物种鉴定的最优DNA条形码,本试验对大黄鱼、小黄鱼、黄姑鱼和棘头梅童鱼4种鱼类71份样本的细胞色素氧化酶亚基I(COI)、线粒体控制区(D-loop)和16S rRNA 3种基因序列进行PCR扩增和测序,分析比较各基因序列比对鉴定能力、种内和种间差异、barcoding gap检验以及序列多态性。结果表明,3种候选DNA条形码序列的种间遗传距离均高于种内遗传距离,符合作为DNA条形码的基本要求。通过遗传差异和barcoding gap检验分析发现,COI和D-loop区适合作为鉴定大黄鱼、小黄鱼、黄姑鱼和棘头梅童鱼4种石首科鱼类的DNA条形码;16S rRNA基因存在一定的缺陷,但是D-loop区和16S rRNA基因序列可能存在比COI通用序列更为有效的DNA条形码区域。考虑引物通用性,推荐COI基因作为最适DNA条形码。本研究结果为海洋鱼类的快速鉴定提供了一定的参考依据。     

盐碱池塘养殖鲤肠道菌群的分子分析

为了了解盐碱池塘养殖鲤肠道细菌群落组成及多样性,提取鲤(Cyprinus carpio L.)肠道细菌基因组DNA,选用细菌通用引物对16S rRNA基因进行了PCR扩增,构建了细菌16S rRNA基因克隆文库。通过对阳性克隆子进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),选出有代表性的克隆子进行测序、BLAST比对分析和构建系统发育树。本研究从16S rRNA基因文库中共筛选出176个阳性克隆,经RFLP分析得到28个不同分类操作单元(operational taxonomic unite,OTU)(GenBank登录号:JX262557~JX262584),文库覆盖度为88.6%。16S rRNA序列系统发育分析发现,盐碱塘养殖鲤肠道细菌归属于变形细菌门(Proteobacteria)(包含Alpha和Gamma亚群)、厚壁细菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)4个门,分别占克隆总数的89.9%、7.9%、1.1%和1.1%。其中,变形细菌门的α-变形菌纲(占克隆总数的88.1%)为优势类群,气单胞菌属为优势菌属。本研究揭示了盐碱池塘养殖条件下健康鲤肠道细菌群落组成。     

广东养殖尼罗罗非鱼3个不同群体MHC ⅡB基因序列多态性和遗传分化

利用一对特异性引物MHC 2b-snp-sf和MHC 2b-snp-sr,从广东省3个不同罗非鱼养殖地区（以下分别称高要群体,茂名群体,惠州群体）采集的137尾尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus,GIFT strain）的个体基因组中扩增出长度为775-796 bp的片段。克隆后测序,序列分析结果显示：775-796 bp的核苷酸序列中共检测出62个简约信息位点,49个单碱基突变位点。112个多态位点中,增添/缺失位点34个,转换位点44个,颠换位点33个,另外一个位点既出现转换（C/T）又出现颠换（A/T）。137尾个体的751个阳性克隆的测序结果分析表明,751条序列分属于4个等位基因。其中,等位基因Orni-DAB＊0101在3个群体中所占比例最高（85.2%）。等位基因的分布及群体内遗传多样性参数分析表明：高要、茂名群体遗传多样性较丰富,惠州群体遗传多样性较低。群体间的分化指数（FST值）、平均基因流（Nm）、分子方差分析（AMOVA）和平均K2-P遗传距离均表明3个养殖群体间存在广泛的基因交流,未发生群体间的遗传分化。该研究结果提供了广东地区养殖尼罗罗非鱼MHCⅡB基因的部分遗传信息,为尼罗罗非鱼抗病品系的选育提供理论依据。     

玉米脱镁叶绿酸氧化酶基因ZmPAO表达与叶绿素含量动态变化的关联分析

【目的】分析玉米脱镁叶绿酸氧化酶基因ZmPAO序列多态性,并挖掘该基因与玉米成熟后期穗位叶叶绿素组分含量相关的功能位点,为基于ZmPAO开发功能标记提供结构信息,有助于对玉米成熟后期叶绿素代谢遗传机制的理解。【方法】以141份具有广泛遗传变异的玉米自交系为试验材料组成关联群体,以2个环境7个时间点的叶绿素组分含量为表型数据,利用Tassel 5.0通过混合线性模型 (MLM,mixed linear model) 开展玉米脱镁叶绿酸氧化酶基因 (ZmPAO) 与成熟后不同时期叶绿素组分变化的相关变异位点的关联分析,并对性状的有效关联位点进行单倍型分析。【结果】在玉米生长后期大部分取样时间点的叶绿素组分含量变异较大,叶绿素a普遍低于叶绿素b的含量,最终总叶绿素 (叶绿素a与叶绿素b的和) 有下降趋势。结果共鉴定ZmPAO中19个有效功能位点,其中4个处于外显子区,1个位于UTR区域,其他均位于内含子区域;功能位点对叶绿素组分含量变异的表型解释率在3.89%～16.57%,总表型效应在5.24%～41.78%。来自第6个内含子的位点S3235对于Yang-chlb6有高达16.57%的表型解释率;第7外显子S3675分别解释了Yang-chla1和Yang-chlb1表型变异的12.16%和14.14%。性状显著单倍型中有利位点和关联分析的变异位点偏好相似。【结论】有效功能位点挖掘和性状单倍型分析表明,ZmPAO外显子发生了2个氨基酸变异,均由疏水氨基酸转化为亲水氨基酸,说明该基因可能通过蛋白结构的变异进行调控,但较多关联位点处于非编码区,说明该基因也受转录水平的调控。转录水平受环境影响较大,故导致该基因出现不同地点因播期和生育期的不同找到的关联位点并不一致,但有效变异位点的存在具有普遍性。     

天山云杉林下土壤放线菌的分离与DNA指纹分析方法的初步研究

新疆天山土壤放线菌的分离和鉴定工作,对全面了解该地区放线菌分布状况具有重要意义。使用7种典型的放线菌分离培养基对土样中的放线菌进行分离,共得到8个属的放线菌分离株,并对分离培养基的分离效果进行比较。使用MseI、AluI、PstI和HhaI 4种限制性内切酶对20株链霉菌分离株的16S rRNA基因进行了PCR-RFLP分析。使用BOX-PCR方法构建了9株稀有放线菌菌株的指纹图谱。PCR-RFLP和BOX-PCR聚类分析结果分别与16S rRNA基因全序列聚类分析结果具有一致性。因此,PCR-RFLP和BOX-PCR指纹分析技术可在一定程度上代替16S rRNA基因全序列分析,用于新疆天山土壤放线菌的快速鉴定和多样性研究。     

藏绵羊DRB3基因第2外显子多态性分析

为了研究藏绵羊(Ovis aries)DRB3基因的多态性,确定其等位基因数、等位基因间的核苷酸多态位点、变异类型,以及分析各等位基因间的遗传关系和进化意义,研究采用PCR-SSCP方法检测了500只藏绵羊DRB3基因第2外显子的多态性,并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因.结果表明藏绵羊DRB3基因第2外显子表现了37个等位基因,37个单倍型序列分析发现82个核苷酸多态位点;37个单倍型序列与GenBank下载序列对比分析,结果表明35个DRB3的等位基因是本研究旨次发现;37个DRB3基因外显子2的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势.研究认为藏绵羊DRB3基因第2外显子具有丰富的遗传多态性;藏绵羊DRB3基因最初是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因的.     

鲮微卫星DNA分子标记的筛选与遗传多样性分析

采用磁珠富集法对已建立的生长较快的西江段野生浅色鲮群体的极大、极小群体各31尾基因组DNA进行了微卫星序列的筛选,128个阳性克隆成功测序93个,其中80个为的微卫星序列,微卫星序列完美型占85％,非完美型占6．25％,混合型占8．75％。利用微卫星序列合成了23对微卫星引物,扩增结果表明,等位基因数为1～10个,扩增片段大小为92～283bp,其中14对引物扩增条带清晰,为中度或高度多态位点,极大、极小群体的平均有效等位基因数和平均多态信息含量分别为3．0784、3．2079和0．5675、0．5974,反映出2个群体遗传多样性均较丰富;高度多态性引物4的位点b,片段大小为119bp,在极大群体中出现频率为61．3％,在极小群体占22．6％,出现频率极大群体高于极小群体近3倍,初步可作为候选差异性分子标记。     

罗非鱼选育群体Cytb与D-loop序列变异信息对比分析

对罗非鱼选育群体mtDNA Cytb和D-loop序列遗传变异开展对比研究,根据2种方法得到的多态位点比率平均为0.776 74单倍型多样度比率平均为0.919 45核苷酸多样性指数比率平均为0.769 77平均核苷酸差异数比率均值为0.936 19Cytb序列碱基转换率平均0.042 67Cytb碱基颠换率平均0.004 10D-loop序列碱基转换率平均0.037 25D-loop碱基颠换率平均0.022 84。该结果对比揭示了Cytb和D-loop序列分析中的差异,为类似研究提供参考。     

猕猴桃雄性基因RAPD标记S1032-850的获得及其应用

利用RAPD技术对美味猕猴桃(Actinidia deliciosa var.deliciosa)海瓦德×秦雄201杂交F1代雌雄分离群体进行分析,获得了与雄性基因链锁的RAPD标记.通过对300个随机引物的筛选和研究,得到了与猕猴桃雄性基因链锁的RAPD标记S1032-850,并在杂种后代、中华猕猴桃(A.chinensis var.chinensis)和美味猕猴桃雌雄个体上进行了验证.进一步对猕猴桃雄性RAPD标记S1032-850回收、克隆和测序,获得了该标记的核苷酸特定序列,由867bp的特定碱基序列组成,该序列片段已被GenBank收录,登陆号为AY336259.     

绵羊mtDNA D-环序列与微卫星DNA遗传多样性和系统发育分析

采用mtDNA D-环序列和微卫星DNA两种标记方法,对9个绵羊群体225只个体进行遗传多样性和系统发育分析。结果表明：两种方法在遗传多样性分析中得出的结论一致,即在研究的9个绵羊群体中青海藏羊的遗传多样性最丰富,而湖羊和岷县黑裘皮羊遗传多样性都较低。但在系统发育分析中,通过mtDNA D-环序列和微卫星DNA座位数据构建系统发育树,结果表现为很大的不同。由于微卫星DNA符合孟德尔遗传规律,能够反映群体间的亲缘关系,构建的系统发育树结构可靠。mtDNA是核外遗传物质,具有母系遗传的特点,在反映群体间的亲缘关系上不具优势。此外,青海细毛羊和甘肃高山细毛羊的育种实践表明它们的遗传来源相似,亲缘关系相近,这与微卫星DNA座位数据构建系统发育树反映的结果一致,因此,在群体的亲缘关系研究上,微卫星DNA数据分析的结果比mtDNA序列分析结果更可信。172个单倍型序列网络关系分析表明研究的9个绵羊群体可能有三个母系起源。     

Grouping of Bradyrhizobium USDA strains by sequence analysis of 168 rDNA and 168-238 rDNA internal transcribed spacer region

In order to select appropriate Bradyrhizobium USDA reference strains for primary grouping of indigenous soybean bradyrhizobia, we systematically constructed phylogenetic trees of 20 USDA strains based on DNA sequence analysis and PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) targeted to 16S rDNA and the internal transcribed spacer (ITS) region between 16S and 23S rDNAs. The phylogenetic trees of 16S rDNA showed 3 major groups, cluster USDA 110 (USDA 62, 110, 122, 125, and 129), cluster USDA 6 (USDA 4, 6^T, 38, 115, 123, 127, 135, and 3622^T) and cluster B. elkanii (USDA 31, 46, 61, 76^T, 94, and 130), as well as the phylogenetically independent strain USDA 124. The topology of the ITS trees was almost similar to that of 16S rDNA, although the positions of two extra-slow-growing strains, USDA 135 and USDA 3622^T were variable among the ITS sequences, PCR-RFLP of the ITS region and 16S rDNA. Only two strains, USDA 110 and USDA 122, harbored hup genes and they fell into the USDA 110 cluster. These results suggest that PCR-RFLP analysis of 16S rDNA and the 16S-23S rDNA ITS region may be useful for the grouping of bradyrhizobia and for the first screening of hup-positive strains. Based on the above results, we propose a minimum set of USDA strains reflecting Bradyrhizobium diversity that includes B. japonicum USDA 6^T, B. japonicum USDA 110, B. japonicum USDA 124, and B. elkanii USDA 76^T. In addition, an extra-slow-growing strain with the serotype USDA 135 might be necessary for genomic diversity analysis of bradyrhizobia, because their phylogenetic positions were variable.     

基于线粒体COⅠ及Cyt b基因的7种龙虾类分子系统关系

运用PCR法扩增湛江沿海海域7种龙虾的线粒体COⅠ和Cytb基因并对其序列进行分析,以分析7种龙虾的分子系统关系。从7种龙虾中扩增到的COⅠ基因片段长度均为650bp,共存在224个核苷酸位点变异,变异率为35.22%,简约信息位点161个;扩增到的Cytb基因片段长度均为536bp,共存在148个核苷酸位点变异,变异率为29.48%,简约信息位点66个。所有的扩增序列中,没有发现碱基的缺失以及插入,序列中的转换大于颠换,且碱基替换多发生于密码子的第3位。以帝加洛真龙虾（Palinurus delagoae）、普通真龙虾（Palinurus elephas）、吉氏真龙虾（Palinurus gilchristi）为外群,对COⅠ和Cytb两个基因序列采用最大简约法（maximum parsimony,MP）和贝叶斯推论法（bayesian inference,BI）构建龙虾类分子系统树。结果显示：日本龙虾和密毛龙虾亲缘关系比较近,而其它5种龙虾与真龙虾属的3种关系较近,与传统的分类存在一定分歧。     

苹果树根际高效解钾菌的筛选及鉴定

为探明苹果树根际解钾菌的种群特征和解钾性能,从苹果树根际土壤中分离获得解钾能力较强的高效解钾菌。本研究以钾长石为唯一钾源,分离获得118株具有解钾活性的菌株,重复片段PCR基因指纹分析(Repetitive-element PCR,rep-PCR)聚为29个类群。利用火焰分光光度法测定菌株解钾能力,获得5株高效解钾菌,平均解钾活性达到41.47mg·L-1,其中K105的解钾能力最强,有效态钾增长23.09%。采用H2O2消煮后测得的K+浓度升高,有效态钾增长最高达31.22%。采用形态特征观察、生理生化特性检测和基于16S r RNA基因序列的系统发育分析对高效解钾菌株进行鉴定。结果表明:K1为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、K98、K105和K115为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、K168为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。研究结果可为开辟新型高效解钾菌,为连作土壤的改良和苹果专用微生物菌肥的开发提供依据。     

橘小实蝇不育雄虫与野生雄虫间遗传分化

对橘小实蝇不育雄虫和福建7个不同地区的野生雄虫共37个个体的线粒体细胞色素氧化酶I（mtDNA COI）基因进行了部分序列测定。在获得的650bp序列中,共有72个变异位点、32个单倍型,其中共享单倍型3种;对所有单倍型聚类分析发现,单倍型在系统树中的分布散乱,没有显示出明显的地理分布族群;结合遗传变异指数（Fst）和净遗传距离（Da）分析认为橘小实蝇不育雄虫与野生虫源间、不同来源的野生虫源间已存有一定程度的遗传分化,但分化程度较低。研究认为应用昆虫不育技术防治橘小实蝇,在饲养过程中需针对不同防治区引进野生虫源复壮,以确保不育雄虫和野生虫源相匹配,提高防治效果。     

西藏牦牛mtDNA 16S rRNA基因的克隆及其遗传多样性分析

本研究首次通过克隆、测序获得了11个西藏牦牛类群共111头个体的mtDNA 16S rRNA基因全序列,并分析了西藏牦牛的遗传多样性、分类关系、起源和分化,为进一步保护和合理利用西藏牦牛遗传资源以及探讨牦牛类群的划分提供分子依据。结果表明：西藏牦牛16S rRNA基因全序列长度为1571 bp或1570 bp（LWQ4）;G＋C平均含量37.8%,具有明显的碱基偏倚性;平均核苷酸多样性（Pi）为0.00291,平均单倍型多样性（Hd）为0.8501±0.0009,111个样本共发现48种单倍型并聚为2簇,表明西藏牦牛具有较高的遗传多样性并存在2个母系起源;Kimura双参数遗传距离范围为0.00098-0.00694,11个西藏牦牛类群划分为2大类：嘉黎牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、工布江达牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛、康布牦牛、桑桑牦牛、江达牦牛、桑日牦牛为一类,类乌齐牦牛单独为一类。本研究发现类乌齐牦牛具有较丰富的遗传多样性,并且发现了一个序列特异个体LWQ4,需要对其进行更深入的研究。牛种间的聚类结果显示,西藏牦牛与美洲野牛的亲缘关系最近,与普通牛、水牛的亲缘关系相对较远,本研究支持将牦牛从牛属（Bos taurus）中分离出来,作为一个独立的牦牛属（Poephagus）的观点。     

一株抗真菌海洋放线菌的筛选、分离和多相分类鉴定

为开发利用宁波近海潮间带药用微生物资源,本研究自宁波慈溪海塘采集7份海泥样品,从中筛选、分离抗真菌放线菌,并对目标菌株进行多相分类鉴定,包括16S rRNA、gyrB基因序列分析、形态观察、生理生化鉴定及细胞化学组成分析。通过筛选培养获得了25个菌株,其中2P-4对白色念珠菌、黑曲霉表现出抑制生长的作用。细胞化学组成鉴定分析了2P-4全细胞糖、氨基酸、极性脂质、甲基萘醌和脂肪酸组成,结果表明,2P-4属于链霉菌属。2P-4的16S rRNA、gyrB基因序列分析也表明2P-4属于链霉菌属,并且与毒三链霉菌的关系最密切,其16S rRNA基因序列与Streptomyces toxytricini NBRC 13194^T的相似度为99.56%,gyrB基因序列与Streptomyces toxytricini NRRL B-5426^T的相似度为99.04%,但16S rRNA、gyrB基因序列在系统进化树上均形成独立分枝,支持2P-4与毒三链霉菌分属不同的种;此外,2P-4与其近缘种Streptomyces toxytricini NBRC 13194^T相比,两者在形态和生理生化特征方面存在明显差异。基于以上分析,初步鉴定2P-4为链霉菌属的一个新种。本研究为进一步探究2P-4抗真菌代谢产物提供了理论依据。     

Genetic diversity among Elaeagnus compatible Frankia strains and sympatric-related nitrogen-fixing actinobacteria revealed by nifH sequence analysis

Elaeagnus compatible Frankia isolates from Tunisian soil have been previously clustered with Frankia, colonizing Elaeagnaceae and Rhamnaceae in two different phylogenetic subgroups, while strain BMG5.6 was described as a new lineage closely related to Frankia and Micromonospora genera. In this study we further assess the diversity of captured Frankia and the relationship with BMG5.6-like actinobacteria, by using nifH gene sequences. Using PCR-RFLP screening on DNA extracted from lobe nodules, additional microsymbionts sharing BMG5.6 features have been detected proving a widespread occurrence of these actinobacteria in Elaeagnus root nodules. Neighbour-Joining trees of Frankia nifH sequences were consistent with previously published 16S rRNA and GlnII phylogenetic trees. Although four main clades could be discerned, actinobacterial strain BMG5.6 was clustered with Frankia strains isolated from Elaeagnus. The present study underscored the emanation of new diazotrophic taxon isolated from actinorhizal nodules occupying intermediate taxonomic position between Frankia and Micromonospora. Moreover, its aberrant position in nifH phylogeny should open network investigations on the natural history of nitrogen-fixing gene among actinobacteria.     

Bacteriological and genetic assessment of game meat from Japanese wild boars

Bacterial tests were used to assess bacterial contamination of game meat from Japanese wild boars. The bacterial contamination of wild boar meat was less than that of domestic pork, as determined by aerobic plate counts (APC) and coliform counts. None of the meat examined in this study was contaminated by Salmonella or E. coli O-157. To detect adulteration by domestic pig meat or European wild boar meat, 46 samples of game meat sold as Japanese wild boar were examined genetically. A total of 17 samples showed genetic haplotypes of European and Asian domestic pigs in the D-loop of mitochondrial DNA (mtDNA), and 16 samples showed nuclear glucosephosphate isomerase-processed pseudogene (GPIP) genotypes of European domestic pigs. The European GPIP genotypes of these samples were confirmed by PCR-RFLP analysis. These results indicate that some game meat sold as Japanese wild boar is adulterated by cross-breeding between pigs and wild boars or by contamination with meat from domestic pigs or European wild boars.