狗牙根SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

利用正交设计,从Mg2 、dNTP、引物浓度和DNA聚合酶4种因素3个水平以及不同的模板DNA浓度来优化狗牙根SRAP-PCR反应体系,并对引物进行了全面筛选。狗牙根SRAP-PCR优化反应体系结果为:2μL 10×buffer4、0 ng模板DNA、Mg2 1.25 mmol/Ld、NTP 260μmol/L、引物0.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL。运用该结果从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物34对。优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用SRAP标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础。     

正交设计优化假俭草SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以假俭草叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2 、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对假俭草SRAP反应体系进行研究,并比较了不同浓度模板DNA对扩增效果的影响,建立了假俭草的SRAP最佳反应体系.结果表明,假俭草SRAP-PCR最佳反应体系为:2 μL 10譖CR buffer、60 ng模板DNA、Mg2 1.50 mmol/L、dNTP 260 μmol/L、引物0.25 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U,总体积为20 μL.各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以Mg2 浓度影响最大,Taq DNA聚合酶的影响最小.运用该体系对4份假俭草种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从45个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的26个引物组合.这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行假俭草分子遗传学研究提供了科学依据.     

正交设计优化草地早熟禾SRAP-PCR反应体系及引物筛选

采用L9(34)正交试验设计方法,对草地早熟禾(Poa pratensis)基因组DNA SRAP PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物及dNTP四因素的用量进行优化,并比较不同模板DNA用量对扩增的影响,建立草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系,同时,利用该体系对SRAP引物进行筛选。结果表明,草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+ 1.75 mmol·L-1、引物0.25 μmol·L-1、dNTP 220 μmol·L-1、40 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer,总体积20 μL。运用该体系从100对SRAP引物中筛选出43对引物能够产生清晰稳定的扩增条带且多态性丰富。优化体系的建立及引物的筛选可为今后利用SRAP标记技术对草地早熟禾进行遗传多样性分析、图谱构建、种质资源鉴定奠定技术基础。     

枇杷iPBS分子标记的PCR体系优化与引物筛选

枇杷的DNA为模板进行iPBS-PCR扩增,采用预实验中效果较好的iPBS分子标记引物2241,对枇杷iPBS-PCR反应体系中的dNTP、Mg2+、引物、模板用量进行优化,根据检测结果确定枇杷iPBS-PCR使用：10×Taq buffer 2μL,25mM Mg2+ 1.6μL,2.5mM dNTP 1.6μL,10μmol/L Primer 1μL,5U/μL Taq酶0.2μL,模板DNA 5ng 的20μL反应体系。反应程序中的退火温度可以参考iPBS引物理论Tm值。对33条iPBS引物扩增测试的结果显示在该反应体系下可以筛选到22谱带清晰、多态性好的引物,可用于枇杷的分子标记分析。     

基于SRAP标记的海雀稗遗传多样性及群体结构分析

采用SRAP标记对来自不同国家的49份海雀稗(Paspalum vaginatum)种质资源遗传多样性进行分析,探讨其群体结构及种质间亲缘关系,为海雀稗种质的开发利用奠定基础.结果表明:从100对引物中共筛选出20对扩增稳定、多态性好的SRAP引物,对49份种质进行PCR扩增,共扩增出169条带,其中多态性条带为118条,多态性位点百分率为69.8％.49份海雀稗种质间遗传相似系数为0.52?0.88,平均值为0.67,表明供试海雀稗种质间存在较大遗传差异.采用UPGMA聚类分析、主成分分析、群体结构分析对49份海雀稗种质进行划分,基本都分为2类,且44份材料在3种方法下均表现为较一致的分类,5份材料表现出一定程度的变异,表明此研究结果反映的种质亲缘关系基本稳定,可用于育种应用.     

红毛丹ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

红毛丹ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选     

基于SRAP标记的海雀稗遗传多样性及群体结构分析

采用SRAP标记对来自不同国家的49份海雀稗(Paspalum vaginatum)种质资源遗传多样性进行分析,探讨其群体结构及种质间亲缘关系,为海雀稗种质的开发利用奠定基础.结果表明:从100对引物中共筛选出20对扩增稳定、多态性好的SRAP引物,对49份种质进行PCR扩增,共扩增出169条带,其中多态性条带为118...     

本氏针茅SRAP PCR反应体系的建立及引物筛选

以本氏针茅（Stipa bungeana）幼嫩叶片为材料,建立适合本氏针茅基因组DNA提取的改良CTAB法,在此基础上采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,对本氏针茅SRAP PCR反应体系中的5个主要因素（DNA、Taq酶、dNTPs、Mg2+和引物）进行优化,旨在建立适合本氏针茅SRAP分析的反应体系。结果表明,在20 μL总的反应体系中各组分的加入量分别为：DNA（20 ng·μL-1）3 μL、Taq DNA酶(5 U·μL-1)0.2 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1)1.4 μL、引物（10 μmol·L-1）1.0 μL、Mg2+ (25 mmol·L-1)2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 8.9 μL。体系验证和引物筛选试验表明,该体系适于本氏针茅遗传多样性分析,该体系的建立可为本氏针茅种质资源遗传多样性研究和黄土高原植被恢复及生态建设提供理论基础。     

航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系的优化以及引物的筛选

航天育种的变异频率高、变异幅度大、有益变异多、稳定性强,优势明显。依据正交试验设计原理,设计了用正交试验和细调正交试验来确定航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系中各成分的浓度,从dNTP、Taq酶、Pri mers、Mg2+4种因素对航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系进行了优化,得到适合航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR最佳反应体系,即25μL的反应体系中含有dNTP 0.2 mmol/L、TaqDNA聚合酶2U、引物0.7μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、以及10×buffer和60 ng模板DNA。在试验确定最佳反应体系基础上,对17对SSR引物进行筛选,选出6对扩增条带信号强、背景清晰的引物。     

海雀稗PvCIPK9基因克隆及耐盐功能鉴定

盐生植物海雀稗(Paspalums vaginatium)是一种极其耐盐的多年生草本植物。本研究从海雀稗转录组数据中筛选对盐胁迫响应的PvCIPK9基因,克隆了PvCIPK9基因CDS序列全长,并对其表达模式、启动子元件等进行分析。为研究PvCIPK9基因的耐盐功能,构建了PvCIPK9过表达载体,采用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),获得过表达PvCIPK9的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana),对转基因拟南芥的耐盐性进行鉴定。结果表明,盐胁迫条件下,转基因拟南芥的生长表型显著优于野生型,转基因拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及相对生长量均显著高于野生型;此外,盐处理后转基因拟南芥的抗氧化酶活性也显著高于野生型,以上结果初步说明过表达PvCIPK9基因增强了拟南芥对盐胁迫的抵抗能力。本研究为深入解析海雀稗PvCIPK9在植物耐盐性中的作用奠定了基础。     

龙爪茅与海滨雀稗抗寒性比较

以海南野生海滨雀稗和海滨雀稗育成品种Salam作对照,对龙爪茅的抗寒性进行了评价。在实验室模拟秋冬季温度条件下,测定了龙爪茅及海滨雀稗的相对电导率（REC）,氧化物歧化酶（SOD）活性和二醛（MDA）含量的变化,并在南京田间条件下观测了各材料越冬期间的枯黄率。结果显示,25～5℃温度处理,各材料基本不受伤害,REC,SOD活性和MDA含量变化不明显。5-0℃条件下,各材料REC基本不变,但SOD活性下降,MDA含量增加。0--16℃条件下,各材料随温度的降低,REC迅速增加,SOD活性迅速降低,而MDA含量升高。通过拟合Logistic方程分析,龙爪茅,海南野生海滨雀稗和Salam的LT5。分别为-4．2,8．0和-8．1℃。田间自然条件下各材料自10月26日开始逐渐表现出枯黄,其枯黄速度龙爪茅最快,海南野生海滨雀稗次之,Salam最慢。结果表明,龙爪茅耐寒性逊于海滨雀稗,其草坪利用需要进行耐寒性方面的驯化选育。     

基于高通量测序的海滨雀稗转录组学研究

采用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq 2000对海滨雀稗叶片转录组进行测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,获得了47520544个序列读取片段(reads),包含了4752054400个碱基序列(bp)信息。对reads进行序列组装,获得81220个单基因簇(unigene),平均长度1077 bp,序列信息达到了87542503 bp。另外从长度分布、GC含量、表达水平等方面对unigene进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。数据库中的序列同源性比较表明,46169个unigene与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。海滨雀稗转录组中的unigene根据GO功能大致可分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类48个分支,其中有大量unigene与代谢进程、结合活性和细胞进程相关。将unigene与COG数据库进行比对,根据其功能大致可分为25类。KEGG 数据库作为参考,依据代谢途径可将unigene定位到112个代谢途径分支,包括苯丙氨酸代谢通路、植物与病原物互作、植物激素生物合成和信号转导、黄酮类化合物合成、萜类骨架生物合成、脂类代谢、RNA降解等。SSR位点查找发现,从81220个unigene中共找到22721个SSR位点。SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的为A/T,其次是CCG/CGG和AGC/CTG。本研究首次对海滨雀稗转录组进行了分析,为草坪草的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据来源。     

金沙湾乡村俱乐部海滨雀稗草坪杂草及化学控制技术研究

 本研究于２００６－２００８年在江苏金沙湾乡村俱乐部进行,明确该球场有草坪杂草２９科９５种,其中禾本科１９种,莎草科３种,阔叶草２７科７３种。其中春季萌发的有５０种,秋季萌发的３６种,春、秋季都萌发的９种。建场初,杂草种类仍保留原生态系的痕迹,经过草坪管理特别是剪草及应用除草剂,杂草种类转为以草坪伴生杂草为优势种。田间杂草化学防除试验表明,砜嘧磺隆（Ｒｉｍｓｕｌｆｕｒｏｎ,ｎ ｛［（４,６-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-２-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｃａｒｂｏｎｙｌ｝-３-（ｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）-２-ｐｙｒｉｄｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）０．０４５～０．０３０ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 与嗪磺隆［Ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ,１-２-ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ-３-（４-ｍｅｔｈｏｘｙ-１,３,５-ｔｒｉａｚｉｎ-２-ｙｌ）ｕｒｅａ］０．０２００～０．０２２８ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 混配秋季在海滨雀稗应用,药后６１和１１５ｄ,对禾草和阔叶草防效为６５．４％～９４．８％。氯吡嘧磺隆（Ｈａｌｏｓｕｌｆｕｒｏｎ ｍｅｔｈｙｌ,ｍｅｔｈｙｌ５-｛［（４,６-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-２-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ｝-３-ｃｈｌｏｒｏ-１-ｍｅｔｈｙ-ｌ １Ｈ-ｐｙｒａｚｏｌｅ-４-ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）０．０３７５～０．０５２５ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 与砜嘧磺隆０．０４５～０．０３０ｋｇａｉ／ｈｍ２ 混配秋季在海滨雀稗应用,药后４９和１０３ｄ,对多年生黑麦草、一年生早熟禾防效为６９．４％～７１．２％。砜嘧磺隆０．０６ｋｇａｉ／ｈｍ^２、氯吡嘧磺隆０．０６７５ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 及嗪磺隆０．０２２８ｋｇａｉ／ｈｍ^２对建植１年的海滨雀稗（品种：Ｓａｌａｍ）生长无影响或甚微,砜嘧磺隆０．１８ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 药后２～４周对海滨雀稗有可见影响,直到药后３６周才恢复。     

盐胁迫对海滨雀稗生长和生理特性的影响

本研究采用不同浓度NaCl溶液(0,100,200,300,400和500 mmol/L)对海滨雀稗进行盐处理,测定了生长势、生物量、叶片相对含水量、质膜透性、叶绿素含量、渗透调节物质含量以及抗氧化酶活性等指标,分析不同程度盐胁迫对海滨雀稗生长和生理特性的影响,并且对其耐盐性进行了评价。结果表明,NaCl胁迫对海滨雀稗的株高、叶长、叶宽和直立茎茎粗产生了抑制作用,对根、茎和叶的干物质积累产生显著影响,并且随着盐浓度的增加呈逐渐降低的趋势;海滨雀稗叶片相对含水量随着NaCl浓度的增加呈下降趋势,而质膜透性、叶绿素(Chl)、丙二醛(MDA)和可溶性糖含量则呈升高趋势;海滨雀稗叶片脯氨酸含量、过氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性均在300 mmol/L NaCl浓度下达到最大值,而且都随NaCl浓度的增加呈先升高后降低的趋势,表明海滨雀稗具有较高的耐盐能力,在盐胁迫下可采取自我保护机制以适应盐逆境,其耐盐阈值为300 mmol/L NaCl浓度。以上生理指标的动态变化反映出海滨雀稗对盐逆境的适应性变化,是抵御盐胁迫的一种积极调节机制。     

海雀稗体细胞低温筛选获得耐寒突变体

旨在细胞水平上建立海雀稗(Paspalum vaginatum Sw.)低温胁迫定向筛选耐寒突变体技术,为开展海雀稗耐寒品种选育提供新途经。于2008年1月以海雀稗Adalay品种(P.vaginatum cv.Adalay)的幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织为材料,分别在6℃和0℃低温条件下进行培养和筛选。试验结果:在6℃和0℃下,培养30 d,愈伤组织的绿苗分化率均在80%以上,比对照处理(培养温度26℃)绿苗分化率略有下降;培养45 d,绿苗分化率分别为60%和50%;培养60 d,绿苗分化率分别降至33%和23%。在0℃下培养75 d,愈伤组织完全丧失分化植株的能力;0℃培养0、30、45和60 d的再生植株叶片的半致死温度分别为:-5.69℃、-6.07℃、-6.35℃和-6.63℃。SRAP分子标记测定结果显示,特异性SRAP标记与海雀稗体细胞突变体的耐寒性相关。海雀稗颗粒状愈伤组织在0℃下培养和筛选45 d和60 d获得了耐寒突变体植株。     

4个海滨雀稗对低温胁迫的生理响应及抗寒性比较

为比较不同品种海滨雀稗的抗寒性,以4个品种的海滨雀稗为供试材料,探讨低温胁迫（4℃）对海滨雀稗的生理影响,并对4个品种的海滨雀稗的抗寒性进行了比较。结果表明低温胁迫能够使海滨雀稗的叶绿素含量增加,处理28d后,PL和Sa的叶绿素含量最高。低温胁迫能够使海滨雀稗的相对电导率和MDA含量增加,在处理第28 d时,Sa的相对电导率和MDA含量显著低于其他品种。海滨雀稗的H₂O₂和O₂^-含量随着低温处理而增加,处理28 d后4个品种间的O₂^-含量没有显著差异,PL和SP品种的H₂O₂含量显著低于其他两个品种。低温使海滨雀稗的SOD活性呈现先升后降,然后再升高的趋势,处理后第28 d,4个品种间没有显著差异;低温胁迫能够使海滨雀稗的POD活性升高,但品种间没有显著差异;低温可以降低海滨雀稗CAT和APX的活性,其中CAT活性4个品种之间没有显著差异,而SI品种的APX活性显著高于其他品种。综合各项生理指标,Sa品种的抗寒性较好。     

海滨雀稗再生体系的建立

以海滨雀稗(Paspalum vaginatum cv.Sea spray)的成熟种子为外植体,运用正交试验设计,在MS基础培养基上添加不同浓度的2,4-D、6-BA、NAA、KT、CuSO4、AHC等外源物质,分析其对愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化的影响,建立海滨雀稗高频再生体系,为基因工程育种奠定基础.试验结果表明,在MS培养基中添加2.0 mg/L 2,4-D和0.5g/L AHC 能提高种子的发芽率至97.50％;最佳胚性愈伤诱导培养基为:MS +2,4-D 3.0mg/L+CuSO4 15.0 mg/L+AHC 1.0g/L,其胚性出愈率为66.88％;最佳分化培养基为:MS+6-BA 8.0mg/L+KT 0.05 mg/L+CuSO4 10.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,其分化率为95.00％.     

海雀稗幼穗离体培养植株再生

本研究旨在离体培养条件下建立起海雀稗植株再生的技术体系,为开展海雀稗细胞和分子生物学育种工作创造条件。以Adalay海雀稗(Paspalum vaginatum Sw.cv.Adalay)的幼穗为外植体材料,在附加2,4-D 2.0~4.0 mg/L稍作修改的MS培养基上,愈伤组织诱导率达90%以上。不同发育时期的幼穗影响其愈伤组织的诱导发生频率:1.0~2.0 cm长的幼穗,愈伤组织诱导率达80%以上;2. 0 cm以上的幼穗,诱导率降至60%以下。在添加2,4-D2.0 mg/L和BAP 0.05 mg/L的愈伤组织诱导培养基上,诱导产生的颗粒状愈伤组织占愈伤组织总数的40%以上。愈伤组织继代培养基中琼脂的用量提高到16 g/L时,愈伤组织在继代培养过程中保持颗粒状结构。颗粒状愈伤组织经连续继代培养3次后转移到附加BAP 2.0 mg/L的分化培养基上,植株再生频率达98%。通过提高愈伤组织继代培养基的渗透压,海雀稗幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织在继代培养过程中能够保持颗粒状的结构和高频率植株再生的能力。     

海滨雀稗栽培品种的形态特征与AFLP分子标记分析

为解决海滨雀稗(Paspalum vaginatum)大面积营养扩繁过程中品种纯度问题,本研究利用AFLP分子标记技术,结合形态学特征,对海滨雀稗品种"Salam","SeaSpray","SeaDwarf","SeaIsle 2000"和一个"SeaDwarf"粗茎变异株系进行遗传差异分析,旨在探讨海滨雀稗品种的快速鉴别方法。结果表明:海滨雀稗的形态学遗传距离与AFLP分子标记相似系数的聚类结果一致,均表明Salam和SeaSpray之间的遗传差异较小,可以聚为一类,SeaD-warf和SeaIsle2000的亲缘关系较近,可以聚为另一类。另外,SeaDwarf粗茎变异株系与SeaDwarf之间的AFLP分子标记的遗传相似系数为0.5281,形态学遗传距离是4.8570,均表明二者之间遗传差异较大,无论是形态特征、还是AFLP分子标记均证实SeaDwarf粗茎株系确实已经变异。因此,AFLP分子标记的方法可用于海滨雀稗品种或者突变体的辅助鉴定。