西瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆和序列分析

西瓜果实因富含类胡萝卜素而具有一系列瓤色。为研究西瓜果实中类胡萝卜素合成过程,利用西瓜参考基因组数据,从红色西瓜材料LSW-177中克隆了一个ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(ZDS)的cDNA全长,命名为ClZDS,该基因编码区为1 731 bp,编码576个氨基酸。亚细胞定位预测显示,ClZDS蛋白可能被定位在叶绿体中;保守结构域和多重序列比对分析显示,西瓜ClZDS蛋白含有高等植物ζ-胡萝卜素脱氢酶特有的NAD结合结构域以及类胡萝卜素结合结构域;系统进化树分析表明ClZDS与同属葫芦科的甜瓜和西葫芦的ZDS蛋白亲缘关系最近,物种间分化程度较小;荧光定量PCR结果显示ClZDS基因在西瓜果实授粉后40 d表达量最高。这些结果为进一步研究ClZDS基因在西瓜果实的类胡萝卜素合成途径中的作用提供了依据。     

黄瓜ABC转运蛋白基因(abca19)的克隆及其对农药霜霉威胁迫的响应

ABC转运蛋白基因与植物的多抗耐药性密切相关,是植物抗农药机理研究的热点。克隆黄瓜ABC转运蛋白基因abca19,分析其编码蛋白的氨基酸序列、理化性质和结构,了解其在霜霉威胁迫条件下的表达规律,为abca19的研究奠定基础,为黄瓜抗农药霜霉威机理研究积累材料。以D0351为材料,根据黄瓜基因组数据库中Csa7M368750.1基因编码区全序列,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,从黄瓜果实cDNA中克隆abca19基因的开放阅读框。定量PCR分析霜霉威胁迫处理条件下,黄瓜果实不同处理时间和黄瓜不同部位abca19的表达变化。abca19序列长度为921bp,注册到Gene Bank,登录号为KC123181。abca19编码306个氨基酸,与大豆(Glycine max)等植物abca19的同源性为80%。该蛋白是一个疏水蛋白,无跨膜结构,包含6个α-螺旋结构,无信号肽。具有蛋白激酶C磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、N-糖基化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点等多个活性位点。霜霉威处理条件下,0.5~6h黄瓜果实处理组abca19相对表达量极显著高于对照,9~48h对照组abca19相对表达量高于处理组,但二者间差异不显著。不同处理时间点(3、9和24h),叶片中abca19相对表达量最高,果实中其次,茎中最低。成功克隆到黄瓜abca19,该基因具有已知物种abca19的特征。霜霉威处理条件下,黄瓜果实abca19参与农药霜霉威胁迫响应,反应迅速且具有时限性。在黄瓜叶片和果实中,abca19积极参与对农药霜霉威胁迫的响应,茎中响应较弱。     

低氮条件下黄瓜寡肽转运蛋白（OPT）基因的克隆及表达分析

根据黄瓜基因组数据库中Csa020719基因编码区全序列设计引物,通过RT-PCR扩增的方法从黄瓜品种津研四号的叶片中克隆得到寡肽转运蛋白基因(oligopeptide transporter gene, OPT)。基因编码区全长为2013 bp。该基因编码的蛋白由20种氨基酸组成,含有670个氨基酸残基,分子量和理论等电点分别为73 kD和8.65。预测由该基因转录的寡肽转运蛋白为疏水蛋白,有14个连续的疏水片断。预测该蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白,存在OPT家族保守结构域,亚细胞定位在细胞膜上,主要功能为参与转运和底物结合。同源性和进化树的预测分析显示,OPT蛋白与毛果杨和蓖麻寡肽转运蛋白同源性分别达到了81%和79%,所转运的底物除有寡肽外,还包含有金属离子-烟草胺的螯合物等。 qRT-PCR分析同一氮浓度处理OPT基因在不同部位表达结果显示,在无氮及低氮条件下,OPT基因在茎中表达量最高,其次为叶和茎尖。在高氮条件下,OPT主要在茎尖和叶中表达量较高,其次为茎,说明OPT基因在氮胁迫下存在于植物各个部位,并主要集中在生长旺盛的部位,为黄瓜的生长提供所需的能量。不同氮浓度下OPT在茎中表达分析结果显示,OPT基因在无氮及低氮下表达量增加,明显高于正常水平,并且随着氮浓度的降低,OPT的表达量增加,说明黄瓜OPT基因参与低氮胁迫应答反应,增强黄瓜耐低氮能力。     

番木瓜成熟衰老蛋白基因CpSSA的克隆与表达分析

衰老相关蛋白(senescence-associated protein,SSA)基因在果实成熟衰老中起重要作用。为了探究番木瓜衰老相关蛋白基因,以‘大白八号’番木瓜果实为材料,采用RACE技术扩增出番木瓜SSA基因全长cDNA序列,命名为CpSSA(登录号:KX885408)。生物信息学分析显示,CpSSA全长1 203 bp,包含一个420 bp的开放性阅读框。番木瓜SSA蛋白含有139个氨基酸,分子质量为15.172 4 kD,等电点为9.61。该蛋白的氨基酸序列与桃、葡萄、杨树、菠菜的氨基酸序列有较高的同源性。系统进化树显示,番木瓜SSA与葡萄SSA表现出最小的进化距离,亲缘关系最接近。用荧光定量PCR分析在不同处理不同成熟度番木瓜果实中CpSSA基因的表达差异,结果显示在乙烯处理后的6 h和12 h表达量显著升高,在1-MCP处理中表达量较低,在乙烯/1-MCP处理果实中的表达模式与成熟衰老有一定相关性,推测CpSSA基因可能参与了番木瓜果实的成熟衰老进程。     

黄瓜果实CsEXP5基因片段的克隆与序列分析

以授粉后黄瓜幼果组织的总RNA为模板,利用简并引物,采用RT-PCR方法扩增出1条长度为480 bp的cD-NA片段。序列分析结果表明,该cDNA片段与来源于黄瓜根组织的CsEXP5片段序列(AF319471)同属一个基因,序列拼接后得到526 bp的cDNA序列。预测的CsEXP5蛋白具有一系列保守的Trp残基和HFD,KNFRV保守域。该蛋白属于α-扩张蛋白,与CsEXP10蛋白的同源性高达90%。该基因首次从黄瓜幼果中得以克隆,可能与黄瓜果实膨大生长有一定关系。     

甜荞FaesFUL4基因的克隆与表达分析

本研究采用同源克隆的方法,从甜荞(Fagopyrum esculentum Moench.)品种‘北早生’中分离出调控果实发育的FaesFUL4基因,该基因的cDNA序列全长795 bp,包含一个长为714 bp完整的开放阅读框,共编码237个氨基酸和1个终止密码子。分子系统发生分析和同源蛋白比对结果显示:FaesFUL4蛋白属于A类MADS-box基因家族AP1/SQUA亚家族的euFUL进化系,含有MADS、I、K和C末端四个明显的结构域,且C末端转录激活区含有2个保守的模体(Motif):FUL motif和paleoAP1 motif。基因表达的组织特异性分析表明:FaesFUL4基因主要在甜荞叶片、花序和果实中表达,在根和茎中有微量表达,其在花序中的相对表达量最高。进一步分析基因在果实不同发育时期的表达量发现,其在果实迅速膨大期表达量最高。因此推测该基因不但参与调控花器官的发育过程,且对于维持果实的正常发育具有重要作用。     

羊踯躅八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆及表达分析

旨在研究羊踯躅八氢番茄红素脱氢酶基因的功能,为其花瓣着色的分子机理研究提供一定的理论依据。以羊踯躅瓣为材料,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣cDNA中克隆获得到2098 bp的八氢番茄红素脱氢酶基因cDNA序列,命名为RmPDS。序列分析表明,RmPDS基因包含一个长度为1743 bp编码580个氨基酸的开放阅读框。利用NCBI分析该基因的氨基酸序列,Blast序列分析结果显示RmPDS与其他植物PDS蛋白氨基酸的相似性达到87.80%。用MEGA软件构建系统进化树,结果显示羊踯躅PDS与茶树PDS蛋白的亲缘关系最近。荧光定量PCR检测结果表明RmPDS基因在羊踯躅花蕾期和膨大期表达量较低,在初花期表达量最高,盛花期表达量有所降低。RmPDS基因参与羊踯躅花色的形成,研究结果为进一步探究该基因在花色形成中的作用机制奠定基础,同时也为构建杜鹃VIGS体系提供报告基因。     

苦瓜转录因子McEIL2的克隆及其表达分析

本研究从已构建的苦瓜果实均一化文库筛选得到一个EIN3-like同源EST序列,结合RACE技术,克隆得到EIN3基因c DNA全长序列,命名为Mc EIL2(Gen Bank登录号:KF595122)。该基因全长2 122 bp,开放阅读框1 890 bp,编码629个氨基酸,预测该蛋白的分子量为71.58 k D,与黄瓜Cus EIN3、甜瓜Cm EIL1、苜蓿Mt EIL1、绿豆Vr EIL1和番茄Le EIL1的蛋白同源性分别为89.61%、78.37%、71.23%、69.09%和65.66%。Mc EIL2基因的编码蛋白亚细胞定位于细胞核,荧光定量分析表明Mc EIL2基因表达量在幼果期先强后弱,绿熟期最低,破色期表达量大幅增加至最高随后下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控过程。本研究初步明确了Mc EIL2基因在苦瓜成熟过程表达模式,可为今后进一步揭示苦瓜果实成熟软化的分子机制奠定基础。     

黄瓜CsamiR399b及其靶基因CsUBC24的生物信息学分析

为深入研究CsamiR399b对黄瓜果实膨大的影响,对CsamiR399b及其靶基因CsUBC24进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR分析了CsamiR399b的表达特性。结果发现,CsamiR399b前体序列含有完整的茎环结构; CsamiR399b在膨大的黄瓜果实中表达量高于开花当天子房和未膨大子房,证实其参与黄瓜果实膨大调控。对靶基因的生物信息学分析发现,CsUBC24蛋白二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,该蛋白质无信号肽及跨膜结构,定位于细胞核,为可溶性蛋白。系统进化树表明,黄瓜CsUBC24与甜瓜、南瓜和苦瓜等物种UBC24遗传距离较近;通过序列比对和保守域分析发现,各物种UBC24蛋白序列和功能结构域表现出较高的保守性,说明UBC蛋白功能保守。推测CsamiR399b通过调控CsUBC24基因表达参与了黄瓜果实膨大。     

黄瓜苯丙氨酸解氨酶基因CsPAL的克隆及响应白粉菌侵染的表达分析

为了分析苯丙氨酸解氨酶基因(CsPAL)在黄瓜侵染白粉菌中的转录应答响应,对CsPAL基因(GenBank No.JN 675927)及其启动子进行了克隆与序列分析,再利用qRT-PCR技术分析了该基因在黄瓜高抗白粉病品种‘Jin5-508’接种白粉菌后不同时间的相对表达量。结果表明:CsPAL基因全长2 142 bp,编码713个氨基酸;推测CsPAL蛋白存在于细胞质中;系统发育进化树分析发现与拟南芥基因进化距离较近;启动子克隆及序列分析显示该基因能够响应真菌的侵染;组织特异性表达发现CsPAL在在叶片中的表达量最高;qRTPCR结果表明‘:Jin5-508’叶片在接菌16 h内,CsPAL基因的相对表达量于对照间无显著差异;接菌16 h后,CsPAL基因表达量迅速上升,显著高于对照,并在24 h达到最大值;接菌48 h后,CsPAL基因的表达量逐渐下降,但在96 h内仍显著高于相应对照的表达量。综上所述,黄瓜CsPAL基因为白粉菌侵染响应基因,可能与黄瓜对白粉病的抗性具有一定的相关性。     

黄瓜扩张蛋白Cs-EXP10基因5′序列的克隆和表达的初步分析

扩张蛋白是促进植物细胞壁伸展的一类蛋白质,黄瓜果实膨大过程中扩张蛋白具有重要作用.本研究以发育中的黄瓜果实RNA为试验材料,通过RACE方法克隆了黄瓜Cs-EXP10基因的5′端未知序列,进而获得了该基因的全长,序列分析显示该基因编码287个氨基酸,有扩张蛋白的特征序列.Southern杂交表明Cs-EXP10在基因组...     

黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1克隆及表达分析

中国黄瓜品种繁多，但黄瓜的抗逆性不强，容易产生病虫害。因此，分析和验证抗病相关的基因，探究黄瓜抗病的分子机理，可为培育黄瓜抗性品种提供理论基础。本研究以黄瓜为试验材料，采用RT-PCR技术克隆了黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1的cDNA序列全长，并对其进行生物信息学分析；采用荧光定量PCR的方法分析CsATX1基因在细菌性角斑病侵染0～96 h下的表达情况，以期探究其与黄瓜抗病性的关系。结果表明：CsATX1基因序列全长为768 bp，含有一个288 bp的ORF阅读框，可编码95个氨基酸，该基因编码蛋白的相对分子质量约为9.95 kD，理论等电点是5.07，为亲水性蛋白，不具有跨膜结构，不含信号肽序列。系统进化树分析表明Cs ATX1与葫芦科同源蛋白的亲缘关系最近。RT-qPCR分析表明，CsATX1在黄瓜叶中有表达，在黄瓜细菌性角斑病菌侵染下，该基因在黄瓜叶中表达显著增高，受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导。该研究结果为深入探究CsATX1基因功能提供科学依据。     

芒果CHS基因的克隆及其表达分析

为了研究芒果CHS基因的功能及其在果实着色中的分子机理,以芒果果实的c DNA和DNA为模板,采用同源克隆的方法克隆得到了一个CHS基因,该基因的开放阅读框1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点为6.03,分子重量为43.29 k Da。基因组扩增得到了1 315 bp的片段,通过序列比对发现该基因含有1个内含子,对其在幼嫩叶片和成熟叶片中的表达进行分析,发现该基因在不同时期的叶片中都有表达,在红色幼嫩的叶片中表达量较高,成熟叶片中表达较低,初步推断该基因可能的叶片中黄酮类物质合成有密切的关系。通过聚类分析发现该基因编码的蛋白与兜兰、白芨等的CHS蛋白序列亲缘关系较近,可以与白芨、问荆草、甘蓝等聚为一类。     

甜瓜CmDWF1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是调节植物生理活动的重要植物激素,DWF1是油菜素内酯合成途径中重要的合成酶之一。为了研究油菜素内酯合成酶基因DWF1在甜瓜果实发育过程中的功能,从甜瓜中克隆得到CmDWF1基因,并对该基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR方法分析了该基因在甜瓜不同组织器官中的表达。结果表明:CmDWF1基因的开放阅读框片段长为1 701 bp,编码566个氨基酸,预测其编码蛋白的分子质量为66.115 11 ku,理论等电点为6.96,不稳定指数为48.18,总平均亲水性为-0.402,属于亲水性蛋白。CmDWF1蛋白含有FAD-binding-4结构域,推测其具有FAD氧化还原酶特性。该蛋白信号肽序列,在细胞质中的定位系数为9,推测其主要在细胞质中分布。二级结构预测显示,CmDWF1蛋白中α-螺旋的含量相对较高,为37.81%。系统进化分析表明,CmDWF1蛋白与黄瓜的亲缘关系较近;实时定量PCR结果表明,该基因在甜瓜的根、茎及叶中均有表达,但在根中表达量最高,并且在甜瓜果实授粉后25 d内表达量有明显的上升,35～45 d内表达量呈下降趋势。由以上结果可知,CmDWF1基因可能参与甜瓜油菜素内酯的合成,并进一步调节甜瓜的生长发育。     

羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

茄子(Solanum melongena)MADs-box家族基因SmA GL9的克隆与表达分析

本研究以茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2所构建的抑制差减文库(SSH)中差异表达的EST片段fan11为依据,利用RACE技术克隆得到一条与AGL9基因一致性达97.93%的cDNA序列,命名为SmA GL9。生物信息学分析表明,该基因有一个全长726 bp的开放阅读框,编码241个氨基酸,预测蛋白分子量为27.546 2 kD,理论等电点为9.00。保守结构域分析发现该蛋白含有MADS-MEF2-like和K-box两个保守结构域,属MADS-box转录因子。同源进化分析结果显示SmAGL9基因的蛋白质序列与辣椒AGL9基因同源关系相近。RT-qPCR分析表明,低温条件下SmAGL9基因在单性结实和非单性结实的子房和果实发育过程中均有表达,果实发育初期单性结实品系中的表达量显著高于非单性结实品系,推测SmAGL9基因在茄子单性结实子房和果实发育初期具有重要的调控作用。结果可为进一步研究茄子单性结实果实形成的分子机理提供参考。     

香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的分子特征与时空表达模式

为弄清香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因(MaSSIII-1)的分子特征及时空表达模式，以‘巴西蕉’果肉为试材，采用PCR法进行MaSSIII-1基因克隆，通过Quantitative real-time PCR (qPCR)和Western blot技术对MaSSIII-1基因及其蛋白表达模式进行分析。结果显示：MaSSIII-1基因cDNA全长为2397 bp，编码798 个氨基酸，包括4 个典型的结构域，GenBank 登录号为KU757067。MaSSIII-1 基因在香蕉根、球茎、花和苞片中表达量较低，在叶、果皮和果肉中表达量较高；随着香蕉果实发育，MaSSIII-1 基因表达量逐渐上升，在抽蕾后50~60 天达到最大；随着果实采后成熟，MaSSIII-1 表达量在采后5 天达到最大，随后逐渐下降。在香蕉果实不同发育及采后成熟阶段，MaSSIII-1 蛋白呈现出与mRNA水平相一致的表达趋势。证明MaSSIII-1 基因的表达不仅涉及到香蕉果实支链淀粉合成代谢，可能还涉及采后早期果实成熟或者支链淀粉降解。     

梨FWL5基因克隆及表达分析

Fw2.2是调控果实大小的数量性状基因,在果实生长发育过程中扮演重要角色。为探明梨FWL(fruit weight 2.2-like)家族基因在果实发育过程中的作用,本研究以小果型野生杜梨、中果型库尔勒香梨、大果型库尔勒香梨芽变品种‘早美香’以及大果栽培型鸭梨为试验材料,从梨基因组中筛选分离出梨FWL5基因,对该基因进行克隆和序列分析,并利用荧光定量PCR技术检测梨FWL5基因在四个梨品种的果实细胞分裂期表达水平。结果显示,梨FWL5基因开放读码框长度为729 bp,编码了242个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,存在两个跨膜结构。结构域分析发现梨FWL5蛋白包括一个富含半胱氨酸的结构域,属于PLAC8家族基因。系统进化树分析表明,梨FWL5与樱桃Pav CNR12蛋白序列最相近,樱桃PavCNR12蛋白在细胞分裂期能够负调控甜樱桃果实大小,并有可能参与重金属转运。荧光定量PCR检测结果显示,在花期,梨FWL5除在鸭梨盛花期表达量较高,在其余三个梨品种中表达水平相对一致。在幼果期,除‘早美香’外,梨FWL5基因表达水平为杜梨>香梨>鸭梨。本研究结果可为梨FWL5基因在调控果实大小...     

甜瓜CmERFV-4基因cDNA克隆及特性分析

乙稀应答因子(ethylene-responsive factor,ERF)是乙烯信号通路中的组分之一,通过认别并结合下游功能基因启动子顺式作用元件GCC-box,从而实现对植物发育的调控和逆境胁迫的响应。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜为研究材料,从成熟甜瓜果实中克隆得到554 bp的CmERFV-4基因cDNA,基于该cDNA序列,进行了蛋白理化性质、空间结构与系统进化分析。实时荧光定量PCR检测表明,在不同组织检测结果中CmERFV-4基因在子叶中的表达量最高,在不同发育阶段果实检测结果中该基因在授粉后40 d果实中的表达量最高。构建了该基因超表达载体和RNAi载体。     

罗汉果SgNPY2基因的克隆及在单性结实幼果中的表达

在转录组分析基础上,选择罗汉果生长素信号途径关键酶基因NPY2的unigene,结合RACE技术,克隆其全长cDNA;采用实时荧光定量PCR,比较研究该基因在2,4-D诱导单性结实幼果中的表达规律。结果:获得2 465 bp的全长cDNA序列,命名为Sg NPY2,Gen Bank登录号KU554698,最长ORF编码625aa的BTB/NPH3超家族蛋白;分子进化分析表明,该蛋白与黄瓜和西瓜中同源蛋白亲缘关系较近,与桑树的亲缘关系较远;定量分析表明,SgNPY2基因的表达与幼果内源IAA含量表现相反的变化规律,在20日龄以内SgNPY2在罗汉果幼果中均表达,且随着日龄的增加其表达量"先升后降",约7日龄幼果中表达量最高,2,4-D诱导单性结实幼果比人工授粉的相同日龄幼果中的表达量高,至12日和20日龄幼果中达到显著差异,暗示罗汉果幼果中SgNPY2与生长素极性运输及果实起始发育迅速生长密切相关,受2,4-D诱导表达,为深入其功能研究和品种改良提供了基础。