利用CRISPR/Cas9技术创制Rc基因恢复红稻

【目的】将栽培稻品种恢复为米质优、抗逆性强的红稻具有较大的研究价值。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,编辑原花青素转录调节因子Rc基因,恢复红种皮特性,以改良水稻米质,提升抗逆性。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以Rc为靶基因,构建突变载体p YLCRISPR/Cas9-Rc-g RNA,以空育180、上育453为材料,转化获得转基因植株,通过测序手段和表型观察验证成果。【结果】分子水平检测获得Rc突变材料2种,其中KY-1在1414―1417bp缺失4个碱基,终止子突变为苯丙氨酸;SY-1在1411bp处缺失1个碱基,终止子突变为天冬氨酸。2种编辑材料均恢复为红米表型,且具有一定耐盐碱能力。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得恢复红种皮表型的纯合株系,为红米改良提供基础材料。     

高产优质红米杂交中稻新组合渝优红9

渝优红9系重庆市农业科学院用自育不育系渝802A与恢复系渝恢9341配组育成的中迟熟中籼三系杂交水稻新组合,具有丰产稳产、种皮红色、米质较好等特点,2018年通过重庆市农作物品种审定委员会审定,为重庆市首个通过审定的高产优质红米杂交水稻组合。     

基于NYT 1433-2014中48对SSR引物的94份杂交稻亲本DNA分子数字指纹库研究

建立方法简便、分辨率高的水稻品种遗传多态性和真实性鉴定的分子指纹技术对于指导水稻育种和规范种子市场都具有重要意义。农业部颁布的水稻品种鉴定技术规程行业新标准是基于35个不同遗传特点的代表性水稻品种建立的SSR分子标记技术规程。本研究根据该标准方法,对94份杂交水稻亲本材料的遗传多态性和特异性进行了比较分析,结果表明,供试品种间至少具有3对以上引物扩增的DNA片段差异,即利用该标准能很好地区分供试杂交水稻亲本的遗传差异。对新标准中48对推荐引物的比较与分析表明,46对引物扩增的DNA片段多态性较高,而RM176和RM551两对引物扩增带多态性较低,因此在其染色体的其他位点可进一步研究多态性更高的分子标记。与标准中35个水稻品种的指纹库进行比较,发现了16个新的等位变异,这些位点可作为标准指纹库的信息补充,丰富标准库中的遗传信息。对94个杂交水稻亲本的分子指纹比较分析,发现23个亲本材料具有特异性分子标记,这些特异分子标记可应用于杂交组合的真实性以及杂交种子纯度的分子鉴定。根据供试亲本的数字分子指纹,构建了87个不育系与7个父本杂交的虚拟组合数字分子指纹库以及虚拟组合的真实性和纯度快速鉴定的特异数字分子标记。     

大豆褐色种皮遗传分析及基因定位

为解析大豆籽粒种皮黄色向褐色突变的遗传规律及分子基础,本研究以田间发现的稳定繁殖的黄色种皮大豆中出现褐色种皮突变体及其原始品种为材料,进行田间表型性状鉴定。利用大豆20对染色体上的176个SSR标记对4对自然突变为褐色种皮的突变体及其原始品种进行基因型鉴定。利用种皮色突变体与其原始品种和非原始品种进行正向杂交和反向杂交试验,并对F_1、F_2种皮色的分离情况进行统计分析。利用A2连锁群上全部72对SSR标记对双亲遗传背景差异大的北豆14×克H09-95的F_2群体进行基因型鉴定。研究结果表明:褐色种皮的突变体是其对应的原始品种的近等基因系;褐色突变是可遗传的,受细胞核基因控制,与细胞质遗传无关;黄色种皮对自然突变的褐色种皮表现为显性,经卡方检验,杂种后代中种皮的黄色与褐色分离比例符合3∶1的孟德尔的独立遗传规律,与经典遗传学的遗传方式是一致的。突变发生在A2连锁群的sat_162和SSR53区间内。在大豆公共物理图谱(http://www.soybase.org)上SSR53和sat_162区间包含GmIRCHS结构(曾被预测为I基因)区间,因此可证明参与控制种皮或种脐颜色性状的A2染色体上的经典位点I位点自然突变是黄色种皮变为褐色的原因。在研究的过程中,开发了A2染色体上的1个新的控制种皮颜色的标记SSR53。     

基于高密度SNP标记的云南元阳红米种质资源遗传多样性分析

为了明确云南元阳红米地方品种种质资源的遗传背景及遗传多样性,给当地红米种质资源保护与开发利用提供理论依据,对元阳梯田地区的红米种质资源进行了全面收集,并利用分布于水稻12条染色体53 032个SNP标记的水稻50K液相基因芯片对155份红米材料进行全基因组基因型检测,通过群体结构和聚类分析,评价红米种质资源的遗传背景和多样性。通过计算最小等位基因频率（MAF）、核苷酸多态性（pi）、多态性信息含量（PIC）等多个多态性指标,发现元阳红米品种间的位点遗传多样性较低。通过群体结构分析,可将供试材料分为9大类,9个类群之间基因交流不频繁,类群内遗传背景单一,少部分材料具有混合的遗传背景。NJ聚类分析可将供试材料分为明显的籼、粳2大类,其中籼稻类涵盖的材料有140份,占供试材料总数的90%。本研究利用高密度SNP基因型数据揭示了云南元阳地方红米品种的遗传多样性水平较低、种质资源遗传背景单一等特点,通过精准鉴定去除了品种重复,为当地红米种质资源的保护与利用提供理论依据。     

抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特异性分子标记的开发

通过对已克隆的抗稻瘟病基因Pi2、Pi9以及Piz-t进行序列比对,寻找各自特异的核苷酸差异,成功开发了基于PCR技术以及电泳检测技术的Pi2/Pi9/Piz-t以及Piz-t的基因特异性分子标记,能有效地将Pi2/Pi9/Piz-t与该位点上的其他抗性等位基因及感病等位基因区分开,这为分子标记辅助育种及抗病基因聚合提供有效的分子标记。用Pi2/Pi9/Pizt基因特异性分子标记对来自全国各稻区的共101份水稻品种和育种亲本进行分子检测,结果发现,除2个品种检测到Piz-t带型之外,大部分水稻品种不携带这3个抗性基因,这为有目的地开展品种的抗性改良提供了重要的参考信息。     

利用SSR分子标记构建水稻品种DNA指纹图谱的研究进展

SSR分子标记具有数量丰富、共显性遗传、操作简单、结果稳定等优点,已成为水稻品种指纹图谱构建的理想标记。本文综述了水稻品种DNA指纹图谱构建原理、技术要点、发展趋势及其在水稻科研和生产中的重要作用,并就SSR分子标记构建水稻指纹图谱的发展前景进行了分析。     

花生深紫色种皮颜色基因的遗传分析及SSR标记

本文以种皮呈深紫色的花生品种“珍珠黑”和粉红色品种“粤油13”的杂交后代F1-F3群体为材料，通过遗传分析和SSR分子标记探讨花生种皮颜色基因的遗传连锁规律，结果表明，花生深紫色种皮颜色受一对不完全显性主效基因控制，该基因与SSR标记“PM93/630-600”连锁，连锁距离为5.4 cM。     

4个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布

建立稻瘟病抗性基因的分子标记对于培育抗稻瘟病水稻品种有重要意义。本文利用抗稻瘟病基因Pi9、Pi2、Pi5和Pita基因序列与日本晴等位基因的序列差异,建立4个基因的共显性分子标记M-Pi9、M-Pi2、M-Pi5和M-Pita,并用这4个分子标记检测24个抗稻瘟病单基因系和48份水稻亲本,结合48份水稻亲本对广西采集的稻瘟病菌ZB1和ZB13苗瘟抗性鉴定结果,验证4个分子标记的特异性和有效性。结果表明,M-Pi9仅在含Pi9和Piz的单基因系中检测出特异带;M-Pi2仅在含Pi2和Pizt的单基因系中检测出特异带;M-Pi5仅在含Pi5、Pi3和Pii的单基因系中检测出特异条带;M-Pita在含Pita和Pita2的单基因系中检测出特异带。具有M-Pi2特异条带的水稻亲本对ZB1和ZB13均表现出抗性,而具有M-Pi9、M-Pi5或M-Pita特异条带的水稻亲本对ZB13均表现出抗性。     

稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的聚合及其育种价值分析

水稻稻瘟病的发病受外界条件影响较大,单纯依靠人工接种抗性鉴定比较困难。因此,人工接种抗性鉴定与分子标记辅助选择结合应用对提高抗性育种效率具有重要意义。本研究利用已建立的水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2显性分子标记,对黑龙江省主栽品种空育131进行分子标记辅助选择,将Pi1和Pi2基因聚合到空育131中,对其原始亲本和不同基因组合聚合后代进行了稻瘟病田间抗性鉴定,对2个抗性基因的聚合效应进行了统计和评价,由此明确了Pi1和Pi2基因在寒地育种辅助选择中的应用价值。     

普通野生稻红色种皮遗传分析及育种利用初探

利用4份红色种皮的广西普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）与白色种皮籼稻品种93-11杂交,获得F1群体,再自交构建F2群体,对种皮颜色进行遗传分析,发现4份普通野生稻的红色种皮对来自93-11的白色种皮性状均表现为显性遗传。通过杂交、回交和多代自交后,将来自普通野生稻的红色种皮性状导入水稻品种93-11,获得多个农艺性状遗传稳定的红色种皮水稻品系。结果表明,通过常规育种手段可以打破红色种皮与不良农艺性状的连锁,利用野生稻红色种皮特性培育营养丰富具有保健功能的有色稻米品种是可行的。     

4引物分子标记鉴定水稻高光效基因型hd3a~(Kasa)

水稻的抽穗期关乎水稻的光合效率、适应季节和种植范围,其表现直接决定了水稻能否高产稳产。Hd3a编码的成花素是水稻抽穗调控通路中的关键因子,在短日照下促进抽穗,长日照下推迟抽穗。Hd3a包含多个等位基因,其中来自aus稻品种Kasalath的hd3aKasa相比来自温带粳稻品种日本晴(Nipponbare)的Hd3aNip,在第4个外显子处有2个连续的碱基突变(CC→AA),使得hd3aKasa的功能强于Hd3aNip。hd3aKasa是高光效基因型,一般携带hd3aKasa的水稻品种产量更高,但会导致水稻开花推迟,可能影响其正常生产;而杂合态的Hd3aNip/hd3aKasa则表现出产量高和抽穗延迟适中,相比2种纯合基因型更加有利。由于Hd3a的不同等位基因各具优势,处于杂合状态下还可互补,因此建立可精确选择Hd3a等位基因的分子标记在育种实践中意义重大。本研究利用扩增受阻突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)的原理,开发出包含4条引物的共显性分子标记hd3afnp,鉴定Hd3a的功能单核苷酸多态性(Functional nucleotide polymorphism,FNP)。hd3afnp同表型完全连锁,1次PCR反应即可精确区分2种纯合等位基因型及其杂合基因型,从而有助于水稻的高光效分子标记辅助选择育种。     

稻米淀粉理化特性相关的水稻淀粉分支酶基因标记开发

 基于籼稻93 11和粳稻日本晴基因组间的序列差异,成功发展了水稻淀粉分支酶基因(Sbe)9个分子标记。利用这些标记对102份非糯材料进行了基因型检测,并分析了Sbe1、Sbe3基因标记基因型多态性对稻米淀粉理化特性的影响。Sbe1、Sbe3基因标记多态性位点对揭示非糯材料间稻米淀粉理化特性的差异不显著,说明淀粉分支酶基因这些等位性变异位点对非糯稻米的蒸煮食味品质影响不显著;在鉴定籼稻品种时,有6个标记的鉴定准确率达80%以上。还对标记开发的意义和分子标记辅助选择育种进行了探讨。     

黑龙江省抗稻瘟病育种

综述了建国后黑龙江省在抗源搜集与鉴定、抗性基因分析、抗性鉴定方法、生理小种、抗病品种选育等方面的研究与实践。缺少品种抗性遗传基础研究是限制现阶段黑龙江省抗稻瘟病育种开展的重要因素;特异性分子标记可以在开展品种抗性遗传基础研究中发挥重要作用;根据黑龙江省水稻品种骨干亲本来源,在充分利用已开发的Pi-b、Pi-ta和Pi-t这3个基因特异性分子标记的同时,还需密切关注Pi-a、Pi-z和Pi-k等基因特异性分子标记的开发与利用,进而探讨了特异性分子标记开发过程中的难点和需要注意的问题。     

SSR标记技术在水稻遗传育种中的应用

SSR是建立在PCR基础上的分子标记,与RFLP、RAPD、AFLP相比,SSR具有多态性高、结果稳定可靠、重复性好、操作简单等特点,已在水稻研究中被广泛应用。阐述了SSR标记的基本原理与操作规程,介绍了其在构建水稻连锁图谱、水稻品种特异性鉴定及水稻分子标记辅助育种等方面的应用情况。并分析了目前SSR在应用中所存在的问题,提出相应的解决方法,以期推动SSR标记技术在遗传育种研究中的进展,从而加速育种进程。     

一种水稻香味基因功能标记的开发

为了提高水稻香味基因的分子标记辅助选择的准确性,根据水稻隐性香型品种与非香型品种的BAD2基因（即香味基因）序列之间存在8 bp碱基缺失,设计出香味基因fgr的InDel功能标记GRFM04。利用该标记对粤丰B（香型）/振丰B（非香型）的F2分离群体和其他16份香稻品种和6份非香稻品种进行检测验证。依据其PCR扩增产物电泳带型,可以准确地区分出香型纯合基因型、非香型纯合基因型和杂合基因型3种带型,且3种带型与其植株或品种相应的香味性状表现完全呈一一对应关系。     

抗稻瘟病Pid3/Pid3-A4基因特异InDel分子标记开发与应用

为更加高效利用抗稻瘟病基因Pid3/Pid3-A4,通过分析3K水稻测序数据中Pid3基因等位变异,设计了Pid3和Pid3-A4基因特异InDel分子标记Pdg-C与PA4-C,利用这2个标记对中国杂交水稻常用亲本材料或品种以及美国水稻微核心种质资源进行检测.结果 显示,Pdg-C和PA4-C能够分别快速、准确、经济地区分Pid3和Pid3-A4基因;通过克隆测序、表达分析及接菌鉴定,明确了水稻品种华占携带Pid3基因,栽培稻311100携带Pid3-A4基因,它们作为抗病基因供体更便于在水稻育种中利用.     

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率,有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异,利用Tetra-primerARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm,对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F_2分离群体进行基因型检测,并结合穗颈瘟人工接种鉴定,对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明,谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型,且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测,加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。     

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率，有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异，利用Tetra-primer ARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm，对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F2分离群体进行基因型检测，并结合穗颈瘟人工接种鉴定，对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明，谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型，且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测，加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立

 根据抗病基因Pi-ta和感病等位基因pi-ta在DNA序列上的单核苷酸长度多态性（single nucleotide length polymorphisms，简称SNLP）设计了3个特异性引物YL155、YL183和YL200，并分别用蓝色和绿色染料将YL155和YL183进行标记，而YL200不标记。在一个PCR反应中同时加入这3对引物，并应用ABI自动分析仪对PCR产物进行分析，结果发现，抗病基因Pi-ta纯合的样品获得一个峰值为181 bp的图谱，感病等位基因pi-ta纯合的样品获得一个峰值为183 bp的图谱，而抗病基因Pi-ta处于杂合状态的样品出现两个峰。由此建立了水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的共显性分子标记。以杂交组合Katy/RU9101001的12个F2单株和15个水稻品种为材料，利用已建立的显性分子标记和稻瘟病菌人工接种试验对共显性标记的正确性进行了验证，结果发现三者的实验结果完全吻合，因此该共显性标记可应用于水稻抗病基因Pi-ta的分子标记辅助选择。