犬瘟热病毒的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定犬瘟热病毒(CDV)的石河子流行株。[方法]对临床症状疑似犬瘟热和血清学(ELISA)检测为阳性的自然发病犬,取其淋巴结为病料,接种于非洲绿猴肾细胞系(Vero),进行病毒的分离;用RT-PCR检测感染CDV分离株特异性核酸。[结果]病料接种Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),用RT-PCR技术可扩增出CDV特异性核酸,扩增出的基因片段与预期设计的长度相同,所扩增的CDV分离株H基因片段与CDV C54标准强毒株核苷酸同源性为98.4%。[结论]该研究成功分离并鉴定了CDV石河子流行株,为犬瘟热(CD)的确诊提供了依据。     

犬瘟热病毒贵州株CDV-GZ1的分离与鉴定

为丰富我国犬瘟热病(CD)的流行病学资料,同时为CDV贵州分离株主要抗原基因及结构研究奠定基础,对贵阳市某宠物医院犬瘟热病毒金标卡检测呈阳性病死犬的肝脏、肺脏、淋巴结等组织,取适量经混合研磨过滤后,同步接种于Vero传代细胞上进行病毒分离培养,并对该分离毒株进行理化特性、电镜形态、血清学和核酸检测等系列鉴定。结果表明:在Vero细胞上盲传至第6代时稳定出现特征性的CPE,该毒株为RNA囊膜病毒,电镜下可见胞浆包涵体、病毒粒子呈晶格状排列,病毒可被犬瘟热阳性血清中和,分离病毒为犬瘟热病毒并被命名为CDV-GZ1株。     

稳定表达犬SLAM受体的Vero细胞系的建立与应用

信号淋巴细胞活化分子是(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和麻疹病毒(Measles virus,MV)等麻疹病毒属病毒的主要细胞受体,在病毒入侵细胞的过程中具有重要作用。为了构建稳定表达犬SLAM(d SLAM)受体的Vero细胞系,本研究将d SLAM基因克隆至真核表达质粒p CAGG-TK-neo中,在d SLAM基因3’端引入Flag标签序列作为分子标记,并在其下游引入9 nt的Linker序列、猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV) 2A基因以及红色荧光蛋白m Cherry基因,构建了重组质粒p CAGG-dSLAMFlag-mCherry。用该重组质粒转染Vero细胞,经G418压力筛选、红色荧光蛋白表达及表达绿色荧光蛋白的重组CDV(r20/8-EGFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达d SLAM的细胞系。CDV野生型分离株JL17感染试验结果显示,JL17株在第15代次的Vero-dSLAM细胞上可良好生长,而在Vero细胞上不能形成细胞病变。结果表明,Vero-dSLAM细胞可稳定表达d SLAM,为CDV野生型毒株的分离和致病机制研究奠定了基础。     

水貂源犬瘟热病毒的分离鉴定

利用Vero传代细胞从病死水貂肝脏中分离获得1株病毒。该毒株可使培养细胞出现明显的细胞病变(CPE)。以提取病毒感染细胞总RNA为模板进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),结果扩增出的基因片段大小与预期值相符。根据病毒的致细胞病变特征和RT-PCR鉴定结果,确证该毒株为犬瘟热病毒。     

潍坊某猪场一起伪狂犬病的诊治

2014年9月山东潍坊某猪场发生疑似猪伪狂犬病疫情,采集病死仔猪的脑组织等,利用Vero细胞做病毒分离,并设计一对伪狂犬病病毒(PRV)gE基因片段的特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定及家兔接种试验.结果表明:脑组织上清液接种Vero细胞后有典型的细胞病变;PCR扩增产物电泳后显示出990bp长的目的片段,目的片段基因序列与6株PRV毒株的gE基因序列核苷酸同源性在97.7％～ 100％之间,证实该病毒为PRV;分离病毒接种家兔出现典型的伪狂犬病症状.临床诊断结合实验室鉴定以及动物接种试验,确诊该病例为猪伪狂犬病.     

犬瘟热病毒的分离

对流行病学调查、临床症状检查和血清学（ELISA）检测为阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法分别接种于非洲绿猴肾细胞系（Vero）、犬肾细胞系（MDCK）进行病毒的分离.用多聚酶链式反应（RT-PCR）检测感染细胞中的病毒核酸.结果表明,病料接种Vero细胞、MDCK细胞均产生明显的细胞病变（CPE）;用RT-PCR 技术检测病毒感染的细胞培养液,扩增出特异性的产物带,扩增出的片段大小分子长为760bp,与预期设计的长度相同.用Vero细胞同步培养从肠内容物中分离出的病毒命名为犬瘟热病毒GZ1株;用MDCK细胞同步培养从另一只犬的肠内容物中分离出的病毒命名为犬瘟热病毒GZ2株.     

犬瘟热病毒融合蛋白融合区基因的序列分析

以分离的犬瘟热病毒（CDV）株感染Vero细胞后提取病毒RNA，经反转录后，用犬瘟热病毒的1对引物扩增出融合蛋白融合区的基因片断。经序列分析显示：分离株CDV－YZ－0101与CDV－YZ－0103在核苷酸和氨基酸水平上同源性一致，与CDV－YZ－0102、CDV－A75／17、CDV－ONPPDV2、PDV1在核苷酸和氮基酸水平上的同源性分别为99.6%、97.9%、92.9％、98.9%、76.2%、93.3%和98.9%、97.9%、98.9%、83.0%、97.9%，表明分离株和相关毒株的融合区基因存在差别。     

一例犬瘟热的诊断、预防与控制

接诊一宠物犬,鼻镜干裂、干咳,便血,伴有呕吐,眼睛有严重黏性分泌物,通过临床诊断初步诊断为犬瘟热,实验室通过对病例进行RT-PCR鉴定、病毒分离,结果 RT-PCR扩增出900bp左右的目的条带,通过测序分析及序列比对发现,该病毒的核苷酸同源性与NCBI发表的Asia-Ⅰ型核苷酸同源性为97.4%～97.8%,与Asia-Ⅰ型处于统一分支,取患病犬眼鼻分泌物和排泄物,处理后接种非洲绿猴肾细胞(Vero),接种后传至第3代,出现犬瘟热病毒典型细胞病变,进一步确诊该病犬所患病为犬瘟热。该病一旦发病,预后一般较差,对发病症状轻微的犬可给予抗病毒治疗,但该病还应以预防为主,按时接种疫苗,降低该病的发病率,同时也要做好养殖管理、定期消毒,以减少疾病的发生。     

犬瘟热病毒GZ2株的分离鉴定及H基因原核表达质粒构建

对疑似CD的贵宾犬病料进行了CDV的分离和初步鉴定以及H基因的克隆和序列分析,以探讨不同分离株之间H基因的差异。结果表明:采用同步接种的方法,分离到1株犬瘟热病毒(CDV GZ2),并以其RNA为模板,扩增克隆了该病毒血凝素(H)基因,进而构建原核表达质粒pET-H。该毒株H基因ORF大小为1 824bp,可编码607个氨基酸;与国内分离株氨基酸一致性为97.4%～98.5%,与国外分离株为89.6%～95.6%,与疫苗株在89.6%～91.6%。进化分析表明:CDV的分布具有一定地域性,CDV GZ2与国内东北地区分离株亲缘关系近,而与国外分离株亲缘关系相对较远。     

混合培养基用于提高犬瘟热病毒在细胞上的效价研究

[目的]探讨高滴度制备犬瘟热病毒（CDV）的方法,对于提高该疫苗的保护率具有重要意义。[方法]选用FK81细胞,分别应用MEM和混合培养基（MEM和DMEM按9∶1的混合物）进行细胞培养和CDV接种,然后对2种培养基下的总细胞数、CDV的半数细胞感染量（TCID50）及电镜下病毒粒子的形态等进行了比较。[结果]混合培养基在总细胞数、TCID50及病毒粒子的形态方面均优于MEM培养基。同时还发现,在测定CDV的TCID50时,酶联免疫吸附试验（ELISA）法较细胞病变（CPE）法更灵敏。[结论]试验所建立的CDV增殖方法,可望用于犬瘟热疫苗的生产实践。     

犬瘟热病毒H基因5＇端的表达纯化及抗原性分析

为了获得高纯度的犬瘟热病毒5＇端H蛋白,本研究通过参考GenBank中发表的CDVH蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从犬瘟热病毒疫苗毒株CDV3和野毒株CDVSD株提取总RNA,经FIT—PCR扩增得到388bp的基因片段,将目的基因与原核表达载体pET28a（＋）连接构建了pET28a—CDV3-H5和pET28a—CDVSD-H5重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。重组表达载体pET28a—CDVSD—H5在大肠杆菌中成功的表达,目的重组蛋白为22kD,而pET28a—CDV3-H5未能表达。经Ni—NTA洗脱纯化后,rCDVSD—H5蛋白被成功纯化。Western blot分析表叫,表达产物能够被犬抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。为血清学诊断方法的建立和基因工程疫苗的研究奠定基础。     

犬瘟热病毒分离技术研究进展

由犬瘟热病毒感染引发的犬瘟热是多种动物共患的重要传染疾病。病毒分离技术是对该疾病诊断和病原研究方面的必要手段和基础。目前,多种不同动物来源的原代细胞、传代细胞及稳定表达犬瘟热病毒受体——信号淋巴细胞激活因子的细胞系在犬瘟热病毒分离研究中均得到广泛应用。综述当前犬瘟热病毒分离技术的研究进展,并对不同分离方法优缺点进行比较分析。     

麻疹疫苗预防犬瘟热的试验研究*

 为调查麻疹疫苗用于预防犬瘟热的可行性,选择同窝8只土种幼犬,按2～2.5人份/犬的剂量对A组幼犬（n=3）进行2次麻疹弱毒疫苗接种,应用微量中和试验测定免疫前及每次免疫后第7d血清中的犬瘟热病毒（CDV）中和抗体效价,并转移加强免疫犬外周循环全血［（3.2～3.5）mL/犬］给未免疫B组犬（n=3）,3d后用Vero细胞分离培养的第3代CDV昆明分离株,以2000个TCID 50（相当于5600 PFU）/犬的剂量对上述2组犬和对照C组犬（n=2）进行肌肉注射或滴鼻攻毒。结果发现：不论是否接种麻疹弱毒疫苗,所有犬只均未产生可检测到的CDV中和抗体（效价低于1∶4）;攻毒后连续观察14 d,A组与B组均未出现犬瘟热临床症状,C组出现明显的犬瘟热症状但未死亡。以上结果表明：麻疹弱毒疫苗不能诱导犬产生CDV中和抗体,但可诱导产生有效的抗CDV感染的细胞免疫力。     

犬瘟热病毒甘肃株的分离和N蛋白基因遗传进化分析

采用Vero细胞从甘肃2008-2009年疑似犬瘟热感染病犬体内分离到8株病毒,通过RT-PCR方法扩增M蛋白基因初步鉴定所获得毒株均为犬瘟热病毒(CDV)。进一步通过RT-PCR方法扩增分离株的N蛋白基因,并进行序列分析。结果表明,8株分离株均为CDV,它们之间N蛋白基因的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为98.4%~99.7%、98.3%~99.6%;8株CDV分离株的N蛋白基因和TN、A75/17相应序列的核苷酸同源性分别为98.5%~99.5%、97.0%~98.0%,推定的氨基酸同源性分别为98.3%~99.2%、98.7%~99.8%;8株CDV分离株N蛋白基因和疫苗株(Onderstepoort和Snyder Hill)的相应序列的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为93.0%~94.0%、96.8%~98.3%。根据N蛋白基因所建立的遗传系统发育树可知这8株CDV分离株与TN的亲缘关系较近,而与疫苗株处于不同的分支上。说明从甘肃分离的CDV野毒株和TN由同一毒株演化而来,与疫苗株亲缘关系较远。     

犬瘟热病毒感染的诊断方法比较

采用犬瘟热病毒抗原快速检测试纸和RT-PCR方法,对2008～2009年在兰州市和乌鲁木齐市的50份疑似犬瘟热患病犬样品进行检测对比,结果发现这2种方法的符合率达96%。犬瘟热病毒抗原快速检测试纸是一种比较可靠的临床检测犬瘟热病毒感染的方法,而敏感性和特异性很高的RT-PCR方法更适合研究领域。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得On-derstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Western blot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下了基础。