番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98％,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。将LAT52启动子与GUS基因拼接,构建成了双元表达载体。     

香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建

研制经济方便的新型乙肝植物口服疫苗是全球控制乙型肝炎的现实要求。研制乙肝植物口服疫苗遇到的一个主要的困难是HBsAg基因在受体植物中的表达量低。香蕉是植物口服疫苗理想的受体。因此,以香蕉为受体,进一步提高HBsAg基因表达量的研究非常必要。从pBIL2载体上克隆了香蕉果实特异表达的BanLec启动子,并引入了HindⅢ、BamHⅠ酶切位点;利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切YEPFLAG-HBS获得了HBsAg基因;通过BamHⅠ酶切位点,利用T4DNA连接酶连接了BanLec启动子和HBsAg基因,形成BanLec-HBsAg连接片段;再把该片段通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点插入pCAMBIA2300植物表达载体,成功构建香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因表达载体。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

八氢番茄红素合成酶(PSY2)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

板栗IFRs启动子分离及表达载体构建

以湖北省罗田板栗品种乌壳栗为试材,采用染色体步移的方法获得了板栗IFR启动子序列,研究了板栗黄酮代谢途径中关键基因IFR的启动子顺式作用原件及可能对雄花黄酮类物质合成的影响,并构建pCAMBIA1304融合载体。以期揭示板栗雄花黄酮代谢合成途径,IFRs启动子上游所包含的顺式元件对环境和栽培措施的响应及对板栗雄花发育的影响。结果表明:长度为1 688bp的板栗IFRs启动子序列包含多种类型的顺式作用元件,包括光响应元件GT-1motif、ASF-1motif等;与赤霉素,脱落酸、乙烯等相关的激素响应元件,如WRKY motif(赤霉素信号途径转录因子)、GCC-box(乙烯应答元件)以及Dc3(脱落酸响应元件)等;逆境胁迫相关的功能元件,如与抗损伤相关的ERF3、抗病相关的TGTCA-box等。以此推测,CmIFR基因的表达可能会受到以上光、激素、各种生物或者非生物胁迫等因素的影响。为了后期进一步研究启动子的功能,按照启动子功能区域,设计了CmIFR启动子不同长度的6个功能片段,并将这些片段替换pCAMBIA1304中的35S启动子,成功构建了由CmIFRPs启动子不同区域驱动的gus基因的植物表达载体pCAMBIA1304+CmIFRPs。     

梨韧皮部特异表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因的转化和表达

 以 ‘Old Home’ 梨无菌苗叶片为外植体, 利用根癌农杆菌介导将专一在韧皮部表达启动子AtSUC2 驱动下的GUS 基因转入 ‘Old Home’中。筛选出了‘Old Home’ 梨叶片高效遗传转化的最佳条件：农杆菌和外植体在液体培养基上共培比在固体培养基上共培转化率提高5倍。 PCR分析和Southern 杂交鉴定表明GUS 基因已整合到转基因植株的基因组中,组织化学检测和Western 杂交鉴定证明了GUS 基因在转基因植株韧皮部中的表达。     

野生番茄LA2157中热稳定抗根结线虫基因Mi-9候选基因的分离与过表达载体构建

根结线虫是番茄上的重要土传病害,选育抗根结线虫品种是最有效的防治方法,但是目前转育到栽培番茄中的抗根结线虫基因Mi-1在土温高于28℃时就丧失了抗性。本试验利用热稳定抗根结线虫野生番茄材料LA2157,根据Mi-1基因的序列信息,对其中热稳定抗根结线虫Mi-9基因进行同源克隆,在LA2157中共获得2个候选基因片段;通过In-Fusion克隆技术,将候选基因与过表达载体p BI121进行连接,经电泳检测和测序分析,最终构建Mi-9候选基因的过表达重组载体。     

柑橘冷诱导基因及其启动子表达载体构建与瞬时表达分析

【目的】以YFP为报告基因,构建柑橘冷诱导基因及其启动子的植物表达载体。【方法】克隆获得枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8,柠檬中同源基因Clcor8及其启动子p Clcor8;双酶切含启动子的克隆载体和植物表达原始载体p1D4,连接获得含启动子的中间载体;再双酶切含冷诱导基因的克隆载体和中间载体,连接后获得重组质粒;通过冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。【结果】构建了p1D4/p Ptcor8-Ptcor8::YFP,p1D4/p Ptcor8-Clcor8::YFP和p1D4/p Clcor8-Ptcor8::YFP 3个融合表达载体,瞬时表达发现3个融合基因均可在冰糖橙叶片中表达。【结论】3个融合表达载体的成功构建为下一步转化柠檬,分析枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8的功能奠定了基础。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

甘菊BADH基因启动子的克隆与瞬时表达分析

为了给菊花 [Dendronthema ×grandiflora (Ramat.) Kitam.] 的转基因育种提供诱导型启动子,借鉴5′RACE策略,利用锚定PCR步移的方法克隆了甘菊 [Dendranthema lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino] 甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因的4个启动子序列,分别命名为DBP11、DBP12、DBP21和DBP22（GenBank登录号：DQ497620~DQ497623）,序列长度分别为1 230、1 249 、1 273 和574 bp。4个启动子序列对应区域的同源性在89%以上。其中DBP12和DBP21分別是甘菊BADH基因DlBADH1和DlBADH2（GenBank登录号：DQ011151和DQ011152）的启动子序列,DBP11和DBP22为甘菊BADH基因家族中其它成员的启动子序列。序列分析表明,上述启动子序列中均含有多处与水分胁迫和脱落酸诱导相关的顺式作用元件。在表达载体pCAMBIA1305.2的基础上,用所克隆的4个甘菊BADH基因启动子序列分别置换驱动其报告基因表达的35S启动子,建立了新的植物表达载体。用其转化农杆菌,并用叶盘法侵染甘菊,瞬时表达的结果表明,这些启动子序列均具备驱动报告基因表达的功能。     

番茄脱水素基因SlDHN2b 的克隆与表达分析

 利用RT-PCR从番茄叶片中获得脱水素基因（dehydrins）的cDNA序列,命名为SlDHN2b。该基因开放阅读框1 140 bp,编码380个氨基酸。蛋白序列分析表明该蛋白高度亲水。Real-time PCR分析表明该基因受盐、脱水、ABA诱导表达。通过染色体步移技术获得SlDHN2b基因的启动子,PLACE数据库分析预测SlDHN2b启动子序列中含有多种逆境相关的作用元件。Northern杂交表明该基因在叶片中表达量最高,果实、花、茎中次之,根中最少。     

川芎甜菜碱醛脱氢酶cDNA的克隆及其植物表达载体的构建

以川芎为试材,从叶片中提取总RNA,经过RT-FCR获得甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogenase)基因的cDNA,纯化后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌Top10,获得甜菜碱醛脱氢酶全长基因序列,以期构建植物表达载体.结果表明:甜菜碱醛脱氢酶全长核苷酸长度为1 527 bp,编码508个氨基酸.与GenBank中已发表序列HM35276进行比较,核苷酸同源性为100％.将该基因片段克隆到植物表达载体pBI121中,构建重组质粒pBI121/Betaine aldehyde dehydrogenase,并将所获重组质粒经过双酶切和PCR处理后进行序列测定,证实表达载体上含有目的片段,且连接、构建正确,为BADH的进一步表达奠定了基础.     

番茄microRNA基因沉默载体的构建方法

该试验提出了一种简单且快速构建番茄中人工miRNA表达载体的方法,以包含miR319a前体骨架的质粒pRS300为模板,以重叠PCR技术来扩增miR1917的前体。miR1917的靶基因是LeCTR1,是乙烯反应中的一种负调控因子。含有miR1917的重组前体成功地转化到表达载体pGreen0029-35s中,通过植物根癌农杆菌C58介导的叶盘法成功获得了转基因植株。此种方法可为番茄中miRNA的作用机理研究提供一定的理论基础。     

T7RNAP基因的克隆及其质体定位表达载体的构建

为在番茄成熟果实组织中建立T7/T7RNAP质体转基因特异与高效表达系统,本文克隆了原核T7RNAP基因,在添加上质体定位信号肽编码序列后,由番茄果实成熟特异表达启动子PDS和Tnos终止子控制,构成了含有PDS-ptT7RNAP-Tnos基因表达盒的植物基因双元表达载体。该研究为在番茄质体工程中控制外源质体转基因在番茄成熟果实成熟组织中定点表达奠定了基础。     

银杏GinNdly基因的植物表达载体构建

未知功能的植物基因一般需要通过转基因植物来研究和验证。银杏(Ginkgo biloba L．)是一种童期很长的古老植物，LEAFY基因是一个花分生组织特征基因，调控着植物开花的时间。用植物双元表达载体质粒pCAMBl-Al301构建了开花基因，LEAFY的银杏同源基因GinNdly的反义与正义植物表达载体。因pCAMBlAl301质粒的多克隆位点处没有启动子和终止子，将pB1121的35S启动子和nos终止子引入该质粒。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒构建正确，为研究银杏花分生组织特征基因GinNdly奠定了基础。     

桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表达载体的构建

以‘玉露’桃叶片基因组ＤＮＡ为模板,用ＡＣＣ氧化酶基因特异寡聚核苷酸为引物进行ＰＣＲ扩增,得到１．３ｋｂ左右的扩增产物,将其克隆到ｐＵＣ１９加Ｔ载体上,组建亚克隆并进行序列测定,结果表明,该基因全长有１２８８个碱基,由４个外显子和３个内含子组成。外显子由９５７碱基组成,编码３１９个氨基酸。该基因与桃、番茄、矮牵牛、康乃馨、苹果ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为９９．３％,８３．０％,７６．８％,７４．０％,７５．０％。ＲＮＡ点杂交表明,该基因在未成熟果实检测不到杂交信号,随着成熟度增加,硬度下降,基因表达增强。将ＡＣＣ氧化酶基因分别正向和反向克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,并通过酶切分析,ＰＣＲ和点杂交鉴定重组质粒正确。将重组表达质粒导入根癌农杆菌中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定证实质粒已被导入。     

ICE1基因表达载体的构建及对番茄的转化

以pCAMBIA3301质粒为基础,构建了由CaMV35S启动子调控的ICE1基因植物表达载体p3301-ICE1。重组质粒通过农杆菌介导转化番茄品种组培大黄经卡那抗性鉴定,获得5株含ICE1基因的番茄抗性植株,PCR扩增和RT-PCR检测结果表明,其中3株为阳性植株,转化率为60%。转ICE1基因的番茄植株经4℃低温胁迫72h后,与对照植株相比,MDA含量明显降低,Pro含量、POD和CAT活性明显升高。     

LEAFY基因植物表达载体的构建

本研究采用植物中间表达载体pBll21构建拟南芥花分生组织特性基因-LEAFY基因的植物表达载体。LEAYY基因带有植物组成型启动子-CαMV35S。该表达载体的构建为利用LEAFY基因进行木本果树遗传转化创造了条件。