毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析

中链酰基辅酶A合成酶(MACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,催化中链脂肪酸与辅酶A结合形成相应的中链酰基辅酶A。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的4CL基因,克隆得到毛果杨PtMACS1的基因序列(基因编号:estExt_fgenesh4_pg.c_640066)。通过序列分析可知,Box I和Box II两个在4CL中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将PtMACS1与原核表达载体 pET-30a(+) 构建融合表达载体PtMACS1- pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析,研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸、壬酸、癸酸显示出明显活性:Kcat分别为(1302.65)、(1933.46)、(2015.51) mol/(minmg),以该蛋白的最适底物癸酸测得该蛋白的最适反应温度为37 ℃,最适反应pH为7.0。该结果表明,PtMACS1属于毛果杨中链酰基辅酶A合成酶家族一员,为后续毛果杨腺苷酸合成酶超基因家族的鉴定及分类分析提供资料。      

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

纳米二氧化钛对水生生物的急性毒性与安全评价

为系统评价纳米二氧化钛(nTiO₂)对水生生物的安全性,研究其对斜生栅列藻(Scenedesmus obliquus)、大型溞(Daphnia magna Straus)、斑马鱼(Brachydanio rerio),以及非洲爪蟾(Xenopus laevis)蝌蚪的急性毒性,并进行安全评价。结果表明,nTiO₂对斜生栅列藻、大型溞、斑马鱼和非洲爪蟾蝌蚪的急性毒性分别为0.140 mg·L^-1(72 h-EC₅₀)、1.26 mg·L^-1(48 h-EC₅₀)、22.0 mg·L^-1(96 h-LC₅₀)和5.02 mg·L^-1(96 h-LC₅₀),毒性级别分别为高毒、中毒、低毒和中毒。     

外源一氧化氮供体硝普钠对番茄幼苗盐胁迫伤害的缓解作用

以硝普钠(SNP)为NO供体,番茄品种秦丰保冠幼苗为材料,研究50~800 μmol·L^-1 SNP对100 mmol·L^-1 NaCl下番茄幼苗生长、光合色素含量、气体交换参数、叶绿素荧光参数、膜脂过氧化及抗氧化酶活性的影响。结果显示:1)盐胁迫下,不同浓度SNP处理的番茄幼苗生长抑制均能得到有效缓解,同时叶片叶绿素含量、光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、最大荧光(F_m)、PSⅡ最大光化学效率(F_v/F_m)、实际光化学效率(Φ_PSⅡ)和光化学淬灭系数(qP)显著升高,初始荧光(F_o)和非光化学淬灭系数(qN)显著降低,且SNP浓度为100 μmol·L^-1时变幅均达最大;2)番茄幼苗在盐胁迫下叶片过氧化氢酶(CAT)活性变化不显著,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显著升高,除400、800 μmol·L^-1 SNP处理抑制POD活性升高外,各浓度SNP处理均可促进上述3种酶活性的升高,并使叶片丙二醛含量和电解质渗出率显著降低,其中以100 μmol·L^-1 SNP处理时变化最显著。研究表明,外源NO供体SNP主要通过增强番茄幼苗叶片的光合能力来缓解盐胁迫对其造成的氧化伤害,进而提高了番茄植株的耐盐性。     

落叶松-杨栅锈菌MlpNHA1-like基因的克隆及序列分析

落叶松-杨栅锈菌引起的杨树叶锈病是杨树的一种重要病害。通过系统发育分析和序列相似性比对确定落叶松-杨栅锈菌标准菌株基因ID 45128为酿酒酵母NHA1直系同源基因以及基因ID 116278为NHA1相关基因,分别命名为MlpNHA1和MlpNHA1-like。以夏孢子cDNA为模板,运用RT-PCR技术,同源克隆获得中国菌株MlpNHA1-like基因的ORF片段,即MlpNHA1-like (wh03),长度为1 545 bp,编码514个氨基酸。结果表明,生物信息学预测分析显示MlpNHA1-like (wh03)蛋白具有与酿酒酵母NHA1蛋白相同的保守结构域c_cpa1,且同样具有系列疏水跨膜结构,亚细胞定位预测结果表明目的蛋白分布在质膜区域。通过克隆落叶松-杨栅锈菌中国菌株MlpNHA1-like基因并开展序列分析,为解析该锈菌MlpHOG1蛋白介导通路在病原菌侵染致病及响应外界胁迫中的作用提供帮助。     

树冠遮蔽对侧柏生长和叶绿素荧光的影响

以10年生侧柏-山毛桃混植林为研究对象,侧柏纯林为对照（L0,100% NS）,探讨保育植物山毛桃的树冠遮蔽对10年生侧柏形态指标和叶绿素荧光参数的影响。结果表明:1）以山毛桃为保育植物的混植林中,侧柏的高度(H)、胸径(DBH)、冠幅(CW)均显著大于L0;混植林中,处理1（L1,85%NS）显著大于处理2（L2,70%NS）;2）混植林中侧柏的qP、Φ_PSⅡ、F_v/F_m的日均值均高于对照L0,L1的qP日均值最大,L2的Φ_PSⅡ、F_v/F_m日均值最大;而ETR和NPQ的日均值在L0条件下最大;3）qP,Φ_PSⅡ和F_v/F_m的日变化曲线均呈“V”型,而ETR和NPQ均呈倒“V”型;4）侧柏对不同光环境具有较强的适应能力,同时也说明光照不再是影响10年生侧柏生长的主导因子。     

鸭梨幼果石细胞分化期Pb4CL基因表达分析

为揭示梨果实石细胞分化的机理,调控石细胞形成和含量,克隆了鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.‘Yali’)4-香豆酸∶辅酶A连接酶基因Pb4CL片段(Gen Bank登录号:KF177692),该片段长467 bp,经同源性比对,该片段与沙梨、欧洲花楸和枇杷等物种4CL基因高度同源,编码155个氨基酸残基,存在4CL蛋白质高度保守区域,具有腺苷酸合成class I超级结构域。建立了梨Pb4CL基因的荧光实时定量表达检测体系,在石细胞分化期Pb4CL基因相对表达量逐渐升高,后呈下降趋势。     

茶树4-香豆酸辅酶A连接酶基因Cs4CL1的克隆与蛋白表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是木质素合成过程中的关键酶。本试验以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆得到Cs4CL1基因,该基因长度为1 715 bp,开放阅读框长度1 623 bp,编码540个氨基酸。氨基酸同源性分析显示,Cs4CL1蛋白具有植物4CL酶的典型特征,即AMP结合功能域和GEICIRG保守区。系统进化分析显示,Cs4CL1蛋白与蓝果树、烟草、番茄等植物的4CL1蛋白聚为一类,属于4CL亚家族A。利用原核表达系统可诱导出具有活性的Cs4CL1重组蛋白,该蛋白大小为78 kD。本研究为深入解析Cs4CL1在茶树木质素合成途径中的功能奠定了基础。     

大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design（CCD）响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著（P=0.0001）,可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu²⁺>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L^-1,KH₂PO₄ 1 g?L^-1,尿素1.46 g?L^-1,MgSO₄ 0.5 g?L^-1,蛋白胨2 g?L^-1,玉米浆0.5 g?L^-1,CuSO₄ 0.07 g?L^-1,Tween80 3 mL?L^-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL^-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L^-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L^-1?min^-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。     

外源硝态氮对水培鸢尾叶片抗氧化酶活性的影响

以鸢尾为试验材料,采用营养液水培控制溶氧浓度的方法,研究了短期低氧胁迫下外源硝态氮对鸢尾体内的几个逆境指标的影响。NO^-₃浓度共设4个水平:0、7.5、15.0 mmol·L^-1和22.5 mmol·L^-1,以1/2×Hoagland营养液正常低氧处理（NO^-₃浓度7.5 mmol·L^-1）为对照。结果表明:各处理SOD、POD、CAT酶活性均呈现先升高后降低的趋势。与对照相比,营养液加氮处理的SOD、POD、CAT酶活性升高,膜质过氧化程度减轻;氮浓度越大,酶活性升高幅度越大,而营养液缺氮处理的酶活性降低,膜质过氧化程度加重;营养液缺氮处理鸢尾体内的H₂O₂和MDA含量升高,而营养液加氮处理可降低O^·-₂的产生及MDA含量,且NO^-₃离子浓度高时效果更好,说明适当提高营养液中的氮素水平可以缓解低氧胁迫对鸢尾的伤害。     

不同类型盐分对盐穗木种子萌发及幼苗生长的影响

以荒漠植物盐穗木为试验材料，研究其萌发和幼苗生长对不同类型钠盐的响应，探索盐穗木适应不同类型盐渍土的生物机制，旨在为干旱区利用不同类型盐渍土发展盐穗木牧草种植提供了理论依据。研究表明，盐穗木种子的萌发率、萌发速率和萌发势均受到NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃的显著抑制，回归相关分析其萌发时耐受这4种钠盐的临界值分别是336、285、187、130 mmol·L^-1，极限值分别是635、569、409、350 mmol·L^-1。盐穗木萌发时耐盐性较高，特别是耐NaCl。盐穗木幼苗芽长和根长均受到NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃的显著抑制，根受到盐分毒害强于芽。这4种钠盐均显著抑制了盐穗木的种子萌发和幼苗生长，但各种盐分抑制程度不同，二价盐的毒害性强于一价盐，碱性盐的毒害性强于中性盐。盐穗木幼苗可在含盐量较高（200 mmol·L^-1 NaCl或100 mmol·L^-1 Na₂SO₄）的盐渍土上正常生长。因此，盐穗木适宜在氯化盐和硫酸盐为主的盐渍土上引种栽培。     

外源水杨酸对2个杜鹃花品种抗旱性的影响

选择2个抗旱性较差的杜鹃花品种‘蓝茵’（Rhododendron‘Lan Yin’）和‘宁波红’（Rhododendron‘Ningbo Hong’）为试验材料,在不同浓度的水杨酸作用下,观察叶片形态并测定各项生理指标,判断其对杜鹃花抗旱性的影响。结果表明,施用不同浓度水杨酸后,‘宁波红’在水杨酸浓度为0.3、0.5 mmol·L^-1受旱害较轻,‘蓝茵’在水杨酸浓度为0.3、0.5 mmol·L^-1及0.7 mmol·L^-1受旱害较轻。适当浓度的水杨酸能提高杜鹃花叶片的总含水量、自由水含量和束缚水含量,保持较低的自由水/束缚水,能促进其叶绿素的合成,提高细胞内的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等细胞渗透调节物质的浓度,防止细胞膜受损,抑制过氧化氢及丙二醛的积累,保护超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性,从而减轻干旱胁迫对杜鹃花的伤害,提高杜鹃花的抗旱性。     

阳丰甜柿组织培养再生体系的建立

以阳丰甜柿(Diospyros kaki cv.Youhou)的带腋芽茎段为外植体,研究了植物生长调节剂及其浓度配比对其腋芽的诱导、增殖及生根的影响。结果表明,带芽茎段接种在1/2MS+1.0 mg·L^-1ZT+0.1 mg·L^-1IAA培养基培养4周后,腋芽诱导率为77.8%。将萌发的腋芽切成带芽茎段或单株转到1/2MS+1.0 mg·L^-1ZT+2.0 mg·L^-12ip+0.1 mg·L^-1IAA培养基继代培养,最高增殖系数可达4.1。在增殖培养中长至3 cm以上的芽转入1/2MS+0.75 mg·L^-1IBA的生根培养基中暗培养7 d后,转入光下培养30 d,生根率可达73.3%,平均生根数为3.6。该研究建立了阳丰甜柿离体再生体系,为其规模化生产提供了技术平台。     

外源水杨酸对2个绣球品种耐热性影响的研究

选择2个绣球品种‘含羞叶’和‘银边’为试验材料,采用叶片喷施不同浓度水杨酸（SA）溶液（0.25、0.50、0.75 mmol·L^-1和1.00 mmol·L^-1）并结合人工气候室模拟高温胁迫43℃/33℃（昼/夜）的处理方法,从形态表现、光合色素、膜脂过氧化酶、抗氧化酶活性、渗透调节物质等方面研究外源SA在提升绣球耐热性过程中的生理功能及其作用机理。结果表明,施用SA浓度为0.50 mmol·L^-1和0.75 mmol·L^-1后,2个绣球品种叶片受热害影响程度较轻,且施用适当浓度的SA能有效抑制高温胁迫下光合色素的分解,减缓细胞膜的氧化损伤,抑制丙二醛的积累,提升超氧化物歧化酶、过氧化物酶及过氧化氢酶的活性,增加细胞内的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸等细胞渗透调节物质的含量,进而减轻高温胁迫对绣球造成的伤害,诱导绣球耐热性提升,以0.75 mmol·L^-1浓度的SA处理对绣球耐热性提升效果最佳。     

外源水杨酸对盐胁迫下酸枣幼苗生理特性及离子吸收的影响

为探索外源水杨酸（SA）对盐胁迫下酸枣幼苗生长抑制的缓解效应及其生理机制，以酸枣幼苗为材料，采用盆栽控制试验，对100 mmol·L^-1 NaCl处理下酸枣幼苗叶面喷施不同浓度SA（0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0 mmol·L^-1），分析净光合速率及抗氧化酶活性，筛选出缓解效果最佳的SA浓度，并测定植株组织离子含量。结果表明，不同浓度SA喷施能提高盐胁迫下幼苗的净生长高度和净光合速率（P_n），喷施0.8 mmol·L^-1SA 较T100分别提高了111.4%和100.5%，缓解盐胁迫的效果最佳。外源喷施SA降低了叶片中丙二醛（MDA）的含量，在0.8 mmol·L^-1SA处理下MDA比T100处理组降低了34.7%；同时也增强超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的活性，提高抗坏血酸（AsA）和可溶性蛋白的含量，较高浓度SA会抑制过氧化氢酶（CAT）的活性。叶面喷施0.8 mmol·L^-1 SA显著减少盐胁迫下酸枣幼苗体内Na⁺含量，提高Ca²⁺的含量，S0.8比T100处理组幼苗地上与地下部分Na⁺含量分别降低了8.1%和10.0%。外源SA能够提高酸枣幼苗抗氧化能力，清除活性氧，保护膜的正常结构和功能，减少植物对Na⁺的吸收和促进Ca²⁺的积累，缓解盐胁迫对酸枣的伤害，提高植株净光合速率和生长量。     

垂盆草人工种子制作技术研究

选用垂盆草2~4 mm带腋芽茎段作为包埋外植体,研究海藻酸钠浓度、激素配比、活性炭、离子交换时间及人工种子培养条件对人工种子成型、萌发及成苗的影响,探索适合垂盆草的人工种子制作方法。结果表明,采用滴珠法,以MS+4%海藻酸钠+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1GA₃+0.5 mg·L^-1 NAA为人工胚乳,与2% CaCl₂水溶液发生离子交换反应15 min后获得的人工种子呈规则的球形、富弹性,在MS培养基中培养20 d萌发率达95%,30 d生根率达90%,在培养皿中催芽成苗率达60%,为制备垂盆草人工种子的适宜方法。     

扦插基质及生根促进剂对美国红枫扦插繁殖的影响

以美国红枫改良品种（Acer×freemanii ‘Autumn Blaze’）为试验材料,剪取1年生枝条的中上部做插穗,用ABT^1#1 000 mg/L溶液处理插穗,分别扦插在河砂、珍珠岩、蛭石、草炭、炉灰渣、珍珠岩+蛭石、珍珠岩+蛭石+草炭7种不同基质上。选取生根促进剂ABT^1#、IBA、NAA以及IBA+NAA的混合溶液分别设计500、1 000、1 500 mg·L^-1和2 000 mg·L^-1 4个浓度梯度处理插穗,以清水处理作为对照组。结果表明,蛭石与珍珠岩的混合基质为最佳基质,扦插在该基质上的插穗生根率可达到87.3%,平均根数为9.8条,平均根长为7.6 cm,根系效果指数为0.83。用生根促进剂ABT^1#1 000 mg·L^-1、ABT^1# 2 000 mg·L^-1和IBA+NAA 1 000 mg·L^-1处理红枫插穗,生根率分别达到57.8%、58.9%和60.0%,根系效果指数分别达到1.00、1.17和0.71。IBA500 mg/L处理的插穗,生根率为68.9%,但平均根数较少,不适合美国红枫的扦插生根。