Myristic Acid （MA） Promotes Adipogenic Gene Expression and the Differentiation of Porcine Intramuscular Adipocyte Precursor Cells

Intramuscular fat （IMF） content is considered to be a key factor that affects the marbling, tenderness, juiciness and lfavor of pork. To investigate the effects of myristic acid （MA） on the differentiation of porcine intramuscular adipocytes, cells were isolated from longissimus dorsi muscle （LDM） and treated with 0, 10, 50 or 100μmol L-1 MA. The results showed that MA signiifcantly promotes the differentiation of intramuscular adipocytes in a dose-dependent manner. MA also led to a parallel increase in the expression of peroxisome proliferator activated receptor-γ（PPARγ） and adipose-related genes, such as glucose transporter 1 （GLUT1）, lipoprotein lipase （LPL）, adipocyte fatty acid binding protein 4 （FABP4/aP2）, fatty acid translocase （FAT）, acetyl-CoA carboxylaseα（ACCα）, adipose triglyceride lipase （ATGL） and fatty acid synthase （FASN）. However, no signiifcant effects of MA were observed on the expression of CAAT enhancer binding protein-α（C/EBPα） or hormone sensitive lipase （HSL）. The expression of pyruvate dehydrogenase kinase 4 （PDK4） was increased by MA during the early stages of differentiation （day 1-3）. In addition, MA also increased the absolute content of C14 （P〈0.001） and saturated fatty acids （SFA） （P〈0.05） to varying degrees, but no effects were observed on other fatty acids. These results suggest that MA might be able to enhance the IMF content of pork and increase the accumulation of myristic and myristoleic acid in muscle, which might have beneifcial implications for human health.     

Changes of Intramuscular Fat Composition,Lipid Oxidation and Lipase Activity in Biceps femoris and Semimembranosus of Xuanwei Ham During Controlled Salting Stages

Fatty acid composition of neutral lipids （NLs）, phospholipids （PLs） and free fatty acids （FFAs） from intramuscular fat （IMF）, lipid oxidation and lipase activity in muscle Semimembranosus （SM） and msucle Biceps femoris （BF） of dry-cured Xuanwei ham during the 90-d salting stages were analysed. The salt content increased from 0.34 to 3.52%in BF and from 0.10 to 5.42%in SM during the 90 d salting stage, respectively. PLs of IMF in both BF and SM decreased 54.70%（P〈0.001） and 34.64%（P〈0.05）, furthermore, the saturated fatty acids （SFA）, monounsaturated fatty acids （MUFA） and polyunsaturated fatty acids （PUFA） of PLs in both muscles were hydrolysed almost isochronously. FFAs were increased from 0.46 g 100 g-1 lipids to 2.92 g 100 g-1 lipids in BF at the end of salting, which was lower than SM （from 1.29 g 100 g-1 lipids to 9.70 g 100 g-1 lipids）. The activities of acid lipase, neutral lipase and acid phospholipase all remained active in the 90 d. The thiobarbituric acid reactive substances （TBARS） was slowly increased to 1.34 mg kg-1 muscle in BF and to 2.44 mg kg-1 muscle in SM during the salting stage. In conclusion, the controlled salting process prompted the hydrolysis of PLs of IMF notably and increased the lipid oxidation of muscles within some limits.     

携带FAT1-FAT2基因打靶载体构建及其在猪肾细胞的表达与功能鉴定

【目的】ω-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)对人类具有重要的营养价值与医疗作用。随着生物技术的发展,通过转基因技术可实现哺乳动物体内自身合成多不饱和脂肪酸,进而改变猪肉中不饱和脂肪酸的含量和种类,对人类的营养健康具有积极意义。【方法】克隆猪体内缺乏的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因FAT1和Δ-12脂肪酸去饱和酶的关键基因FAT2,构建携带FAT1-FAT2双基因的多位点打靶载体。该载体以猪rRNA基因间的内部转录间隔序列为靶位点;为提高定点整合效率,引入NEO、TK正负筛选系统进行双重选择;加入EGFP报告基因和Cre/Loxp系统,便于筛选阳性同源重组细胞克隆及后期删除筛选基因。将所构建的携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体,通过脂质体介导瞬时转染猪肾细胞PK15。【结果】RT-PCR结果显示,FAT1-FAT2双基因在猪肾细胞PK15中实现表达;脂肪酸测定结果显示,ω-6 PUFAs、ω-3PUFAs在对照组PN1(转染对照质粒PN1)、转染试验组PF1(转染携带FAT1基因)、转染试验组PF1F2(转染携带FAT1-FAT2双基因)中的含量分别为7.9%、7.03%、3.92%和5.64%、7.01%、9.43%,差异均显著;ω-6/ω-3比例由对照组的1.4显著下降到试验组的0.42～1。【结论】构建携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体转染猪肾细胞PK15可以表达产生FAT1-FAT2 mRNA,且可以显著提高转染细胞中ω-3 PUFAs的含量,为下一步生产转FAT1-FAT2双基因猪奠定基础。     

不同品种猪PPARγ和C/EBPα基因表达规律与肌内脂肪含量的相关

【目的】研究PPARγ和C/EBPα基因在猪不同组织、月龄和品种中mRNA的表达规律,结合屠宰试验分析PPARγ和C/EBPα mRNA表达水平对肌内脂肪沉积的影响。【方法】选取3—7月龄的江口萝卜猪、从江香猪和大白猪为试验材料,提取心、肝、脾、肺、肾、小肠、背最长肌和皮下脂肪的总RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ和C/EBPα基因在3个品种不同月龄各组织中mRNA的相对表达量,同时测定背最长肌中的肌内脂肪含量。【结果】PPARγ、C/EBPα在大白猪3-7月龄各组织中均有表达,其中肝、小肠、背最长肌、皮下脂肪的表达水平较高,心、脾、肺、肾的表达水平较低。其中PPARγ在小肠、背最长肌、皮下脂肪中3、4月龄分别与6、7月龄的表达量差异极显著(P0.01),C/EBPα在肝、肺、小肠、皮下脂肪中3月龄与6、7月龄均差异极显著(P0.01);PPARγ、C/EBPα在江口萝卜猪心、脾、肺、肾、背最长肌的表达量最低,在皮下脂肪中最高,具有组织特异性。其表达量随月龄递增而上升,皮下脂肪的增加幅度最大。其中PPARγ在小肠、背最长肌、皮下脂肪中3、4月龄与6、7月龄的表达量差异极显著(P0.01)。C/EBPα在小肠、皮下脂肪中3月龄与5、6、7月龄的表达量均差异极显著(P0.01);PPARγ、C/EBPα在从江香猪心、肝、脾、肺、肾、小肠、背最长肌的表达量较低,在皮下脂肪的表达量最高,PPARγ的表达量随月龄增加而上升的幅度较小,C/EBPα的表达量在各组织中的表达量随时间增加而上升。其在小肠、皮下脂肪、背最长肌中3、4月龄与6、7月龄的表达量差异极显著(P0.01);PPARγ和C/EBPα基因在各组织均有表达,组织间的表达量存在差异,其中在肝、小肠、皮下脂肪中为高丰度表达。随着月龄的增加,PPARγ和C/EBPα基因mRNA的表达模式基本相同,总体呈现上升趋势,6、7月龄的表达水平较高,即随着月龄的增加而逐渐上升,到生长后期维持一个相对稳定水平。总体上皮下脂肪的表达量最高,其次肝、肺、小肠、背最长肌中较高,心、脾、肾中的表达量最低;不同品种间PPARγ、C/EBPα在相同月龄各组织中的表达量存在差异,总体上大白猪中肝、小肠、皮下脂肪中PPARγ和C/EBPα mRNA的表达量分别与江口萝卜猪、从江香猪差异显著;肌内脂肪含量随着月龄的增加持续上升,不同品种间肌内脂肪含量存在差异,其中江口萝卜猪和从江香猪较高。不同品种猪PPARγ和C/EBPα基因的表达量与肌内脂肪含量的相关性分析表明,不同时期基因的表达量与肌内脂肪含量呈不同程度正相关。【结论】猪PPARγ和C/EBPα基因在不同组织、时期和品种中的表达差异可能与脂质代谢和脂肪沉积有关。     

黄淮山羊H FABP基因多态性及其与肌内脂肪含量的关联分析

 运用PCR SSCP技术检测黄淮山羊H FABP基因部分外显子和内含子区域的多态性,采用最小二乘均数法对其与IMF含量的关系进行分析。在2对扩增引物中只检测到1个多态位点,表现为GG和GC两种基因型。GC基因型个体的IMF含量显著高于GG基因型个体,在背最长肌和腿肌中GC基因型个体的IMF含量显著高于GG基因型（P<005）;在胸肌中,GG基因型与GC基因型个体之间的IMF含量无显著差异（P>005）。据此推测,H-FABP基因该多态位点的GC基因型可能是IMF含量性状的有效标记基因型。     

聚肌胞浓度和免疫刺激时间对猪外周血单核细胞基因表达的影响

【目的】聚肌胞（Poly I:C）是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,能够模拟病毒感染后所形成的dsRNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。利用Poly I:C作为免疫刺激剂对猪外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的免疫刺激试验中Poly I:C的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间的研究还未见报道。本研究探讨不同的Poly I:C免疫剂量和免疫刺激时间对猪PBMC各细胞因子和受体基因表达的影响,确定Poly I:C进行免疫试验的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间,为利用Poly I:C进行RNA病毒感染的免疫应答调控机理研究提供试验依据。【方法】以长白仔猪为研究对象,利用分离的PBMC和1﹕5稀释的EDTA-抗凝血,设置Poly I:C浓度梯度（0、10、20和40 μg·mL^-1）和不同的体外免疫刺激培养时间（4、8、12和24 h）,通过荧光定量PCR方法测定Poly I:C免疫刺激下机体激活或者诱导表达的主要细胞因子（IL6,IL8,TNFα,IL10,IRF3,IFNα和IFNγ）和模式识别受体（TLR3和TLR4）的相对表达量,分析利用Poly I:C对猪全血和PBMC进行免疫刺激试验的最佳作用浓度和时间。【结果】猪PBMC中细胞因子和受体基因的表达量受Poly I:C浓度和免疫刺激时间的影响。各基因具有特征性的表达量变化曲线,达到最高表达变化倍数的浓度和体外培养时间各不相同。对于两个干扰素基因IFNα和IFNγ,最高表达量出现在Poly I:C免疫刺激培养4 h,而后随着培养时间的延长表达量逐渐降低,而其他5个细胞因子（IL6,IL8,TNFα,IL10和IRF3）和2个模式识别受体（TLR3和TLR4）基因随着Poly I:C浓度的增加和免疫刺激时间的延长变化倍数逐渐增加,在Poly I:C浓度为20-40 μg·mL^-1,免疫刺激时间为12-24 h达到最高表达量。但是,对于最高表达量出现在浓度20 μg·mL^-1和培养时间12 h的基因,其在浓度为40 μg·mL^-1和培养时间24 h表达变化量只有小幅下降。另外本研究还对比检测了1﹕5稀释血在Poly I:C免疫刺激下主要细胞因子和受体的表达变化,结果表明全血中各细胞因子和受体的整体表达变化倍数比PBMC低很多,特别是对于IL6和IL8这两个PBMC中表达变化很大的基因,全血中表达变化量不仅很小,而且变化趋势相反。相对于PBMC,稀释全血完整地保存了机体的原始状态,但是利用全血进行免疫试验的主要缺点是抗凝剂保留在全血中。研究中EDTAK2抗凝剂能与血液中的钙离子结合成为螯合物,从而阻止血液凝固,但是钙离子是细胞的重要信号分子,钙离子与EDTA的结合对后续的细胞功能可能产生一定的影响。另外,全血中的某些化合物与血浆蛋白的等成分可能参与免疫细胞对Poly I:C免疫刺激的调节,减少了对Poly I:C免疫刺激的应答。【结论】（1）综合分析所检测的细胞因子和受体的变化趋势,利用Poly I:C进行猪PBMC免疫刺激试验的最佳浓度和体外培养时间分别为20 μg·mL^-1和24 h。（2）1﹕5稀释的EDTA-抗凝血对Poly I:C免疫反应反应小,与PBMC对Poly I:C免疫应答有不同的应答反应趋势。     

Expression of BMP Receptors in Porcine Granulosa Cells （GCs） and Their Regulation by Luteinizing Hormone （LH）

Bone morphogenetic proteins (BMPs) play critical roles in follicle growth and development. BMPs initiate signaling by assembling BMP receptors and activating Smads, which in turn alter expression of target enes. The mechanism underlying the regulation of the expression of BMP receptors and Smads during follicle development in pigs is still unknown. By quantitative real-time PCR, the mRNA expression of BMP receptors and Smads in granulosa cells (GC) was investigated.Cells were obtained from small porcine follicles (SF; <3 mm diameter) and dominant follicles (DF; >6 mm diameter); ActRIA and BMPR2 mRNA levels in DF were significantly higher (P<0.05) than that in SF, whereas BMPRIB, Smad4 and Smad7 expression tended to decrease (P>0.05). The levels of BMPRIA, ActR2, Smadl, Smad5, and Smad8 mRNA did not differ between DFs and SFs. To investigate the effect of LH on BMP receptors in GC, cells obtained from porcine DFs were cultured in medium supplemented with different doses of luteinizing hormone (LH). High doses of LH (4 IU mL-1)significantly decreased the concentration of estradiol (E2) and progesterone (P4) in medium and the expression of Cyp19a1 (P450 aromatase, P450arom) and Cypl lal (cholesterol side-chain cleavage enzyme P450, P450scc), while significantly increased viable cell numbers and up-regulated expression of cyclin dependent kinase-4 (CDK4) and cyclin D2. However,LH had no effect on the expression of BMP receptor genes. Thus, the present study indicates that the expression of members of the BMP signaling pathway in porcine GC is regulated during follicle development and the expression of BMP receptors are not regulated by LH in porcine GCs.     

猪围脂滴蛋白基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

采用比较基因组学和简并PCR方法,根据人、小鼠和大鼠等物种PLIN基因的序列,设计简并引物,克隆了猪PLIN基因包括起始密码子的部分cDNA序列,大小为978 bp(GenBank登录号为EU416277)。该序列与人和小鼠相应序列的相似性分别为87%和83%,编码325个氨基酸,具有1个PAT-1结构域、2个蛋白激酶A位点和1个富含谷氨酸的酸性基序,预测的氨基酸序列与人、小鼠、牛和绵羊相应区域序列的相似性分别为87%,82%,86%,86%。该基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。     

母鸡限饲对子代脂肪沉积、相关酶活性及其基因表达的影响

 【目的】本试验旨在研究母鸡采食量限饲对子代脂肪沉积、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)活性及其基因表达的影响,探讨母体营养效应及子代后天的补偿作用。【方法】选择东北农业大学繁育的高、低脂系肉种母鸡各384羽,分别分为两个处理组。产蛋期,处理一饲喂正常日粮,处理二日采食量是处理一的75%。产蛋高峰期收集种蛋进行孵化。子代自由采食常规水平日粮。【结果】母鸡采食量限饲显著提高子代28日龄腿肌脂肪含量(P＜0.05),56日龄时差异不显著(P＞0.05);子代肝脏脂肪含量品系间存在差异,高脂系显著高于低脂系(P＜0.05);品系与采食水平的互作对子代肝脏脂肪含量和28日龄胸肌脂肪含量影响显著(P＜0.05);子代腹脂率品系间差异极显著(P＜0.01)。56日龄时,子代肝脏FAS酶活性品系间差异显著(P＜0.05),品系与饲喂水平的互作对肝脏FAS酶活性影响显著(P＜0.05)。子代肝脏FAS mRNA表达丰度1日龄时品系间差异显著(P＜0.05);28日龄时,品系与饲喂水平的互作对肝脏FAS mRNA的表达影响显著(P＜0.05);母鸡采食量限饲显著提高了28日龄子代肝脏FAS mRNA的表达丰度(P＜0.05);56日龄时差异不显著(P＞0.05)。【结论】母鸡采食量限饲影响子代脂肪的沉积,且品系间表现出不同的趋势;56日龄时,肉仔鸡肝脏FAS酶活性品系间差异显著(P＜0.05),且品系与饲喂水平的交互作用影响显著(P＜0.05);肉仔鸡肝脏FAS mRNA的表达丰度受母体效应的影响,并且在其后生长过程中表现出补偿作用。     

7个油梨品种(系)果肉的脂肪酸含量及其相关性

为油梨果肉油脂开发和品质育种奠定基础,采用索氏提取法和气质联用法对国内油梨品种(系)RN-1、RN-5、RN-11、RN-12、RN-15、RN-16和国外品种Hass等果肉的含油量和脂肪酸成分进行测定,并进行相关性与聚类分析。结果表明:7个油梨品(系)果肉含油量为5.04~8.75g/100g FW,且差异显著(P0.05),其中RN-5的含油量最高,达8.75g/100g;果肉均含有8种脂肪酸成分,在大部分油梨品种(系)间差异显著(P0.05),相对含量为棕榈酸(30.87%)油酸(29.48%)亚油酸(26.58%)棕榈油酸(9.96%)亚麻酸(1.30%)硬脂酸(1.16%)花生酸(1.02%)肉豆蔻酸(0.23%)。不饱和脂肪酸相对含量为62.80%~70.60%,其中油酸相对含量大于30%的品种(系)3个,为RN-1、RN-15和RN-16;亚油酸相对含量大于25%的4个,为RN-1、RN-5、RN-12、RN-15和RN-16;棕榈油酸相对含量大于10%的3个,为RN-5、RN-11和Hass。亚麻酸与花生酸的相对含量呈极显著正相关,肉豆蔻酸与亚油酸呈显著正相关。基于8种脂肪酸成分相对含量聚类,RN-1、RN-5、RN-11、RN-16和Hass聚为一组,RN-12和RN-15各为一组。油梨果肉具有较高含油量和适宜的脂肪酸含量,其中RN-5在油脂开发和品质育种上具有较好的开发利用前景。     

SCD1基因不同基因型的差异表达及与牛奶中脂肪酸组成的相关性

【目的】探索中国南方荷斯坦奶牛SCD1基因不同基因型的差异表达及与牛奶中脂肪酸组成的相关性。【方法】以同一奶牛养殖场的303头中国荷斯坦奶牛为样本,利用PCR-SSCP技术检测SCD1基因第5外显子878 bp位置的多态性,采用定量FQ-PCR技术初步检测3种基因型的相对表达量,并运用气相色谱技术分析牛奶中脂肪酸的组成。【结果】共检测到3种基因型,即CC、CT和TT,基因型频率分别为0.617、0.339和0.044,等位基因C和T的频率分别为0.787和0.213,仅发现CT表达量显著高于TT（P＜0.05）。CC、CT和TT在脂肪酸C4﹕0、C12﹕0、C17﹕0上存在显著差异（P＜0.05）;在脂肪酸C6﹕0、C8﹕0、C14﹕0、C15﹕0和c9t11CLA上,3种基因型间差异极显著（P＜0.01）。在总饱和脂肪酸含量上TT显著高于CC和CT（P＜0.05）。【结论】SCD1基因C878T位点的突变对中国荷斯坦牛SCD1基因不同基因型的表达和乳脂肪酸成分有较大的遗传效应。     

猪精原干细胞体外培养条件的优化

以出生后1～5 d的长白公猪为主要研究对象,采用两步酶消化法获取睾丸细胞悬液,用Percoll不连续密度梯度法对猪精原干细胞(PSSCs)进行纯化,以碱性磷酸酶(AP)染色鉴定;利用MTT法检测2种细胞因子——胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对PSSCs发育的影响.结果表明:用Percoll不连续密度梯度法获得的PSSCs占睾丸总细胞数的(8.19±0.83)%,AP染色的阳性率为(87.47±2.90)%,表明该方法可有效获取PSSCs;MTT法检测表明,20 ng.mL-1 GDNF+1 000 U.mL-1 LIF的组合添加对PSSCs体外增殖的效果最好.     

母猪哺乳期蛋白限饲对子代血脂水平、肌内脂肪含量及H-FABP基因表达的影响

【目的】本试验旨在研究哺乳期母猪蛋白限饲对子代血脂水平、肌内脂肪含量及H-FABP基因表达的影响。【方法】选取胎次、体重相近(180±5kg)、经同期纯种繁育的民猪及长白猪妊娠母猪12头(民猪和长白猪各6头)。将每个品种母猪随机分为2组,每组3个重复,每个重复1头母猪。供试母猪妊娠期营养水平相同,哺乳期对照组日粮蛋白水平为18%,限饲组蛋白水平为9%。在子代猪断奶(28d)和出栏(180d)时测定血清中血脂水平、背最长肌中肌内脂肪含量及心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因相对表达量。【结果】母猪哺乳期蛋白限饲显著提高了长白猪子代28d时血清总胆固醇(CHO)含量(P0.05),对180d子代影响不显著;有提高长白猪子代28d及180d时血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL),降低高密度脂蛋白(HDL)含量的趋势,但差异不显著;民猪限饲组子代28d及180d时血清中CHO、TG和LDL含量高于对照组,HDL含量低于对照组,但差异均不显著。母猪哺乳期蛋白限饲显著提高了长白猪子代28d时肌内脂肪含量及H-FABP mRNA相对表达量(P0.05),对180d子代也有一定程度的提高,且有提高民猪子代28d和180d肌内脂肪含量及H-FABP mRNA相对表达量的趋势,但差异均不显著。【结论】母猪哺乳期蛋白限饲可对子代早期脂肪沉积产生不同程度的母体效应,但这种影响随着日龄的增加而减弱,存在补偿效应,且猪种间表现出一定的差异。     

A-FABP基因表达与拜城油鸡公鸡肌内脂肪的相关性研究

[目的]研究拜城油鸡公鸡A-FABP基因的表达与肌内脂肪含量之间的相关性。[方法]随机选取拜城油鸡公鸡90只,随机分为3组,每组30只。采用索氏抽提法和荧光定量PCR方法分别在12、18和24周龄测定胸肌和腿肌中肌内脂肪含量和A-FABP基因的相对表达量。[结果]随着周龄的增长,肌内脂肪含量显著增加,相同周龄拜城油鸡公鸡腿肌中肌内脂肪含量极显著高于胸肌中肌内脂肪含量(P0.01)。不同周龄间、胸肌和腿肌间A-FABP基因的相对表达量差异不显著(P0.05)。[结论]拜城油鸡公鸡A-FABP基因的表达水平与肌内脂肪含量没有显著相关。     

腺苷甲硫氨酸对成肌细胞成脂分化及脂肪沉积的影响

【目的】以小鼠成肌细胞（C2C12）为模型探讨蛋氨酸代谢产物腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）对肌肉来源的多能干细胞成脂分化及脂肪沉积的影响。【方法】分别用含有0、0.25、1.0和2.0 mmol•L-1 SAM的培养基处理细胞,在处理后的0、24、36和48 h分别对各处理组细胞进行油红O染色观察细胞形态并测定光密度（OD）值;在处理后第2天收集细胞总RNA与总蛋白,分别用RT-PCR和western blotting方法检测细胞成脂相关基因的mRNA与蛋白表达水平。【结果】经SAM处理后,细胞表现出脂肪细胞的形态特征;细胞内脂肪沉积水平上升,并且随SAM处理浓度的升高呈现出剂量依赖效应;细胞的脂肪特异性基因PPARγ、C/EBPα的mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;其它特异性基因aP2、FAS及SREBP-1的表达在经SAM处理后呈剂量依赖性升高（P＜0.05）,其中2.0 mmol•L-1 SAM处理组升高最为显著,三者mRNA表达水平分别上升了6.86（P＜0.01）、3.45（P＜0.05）和3.48（P＜0.01）倍。【结论】SAM可以促进C2C12细胞成脂分化及细胞内脂肪的沉积。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体的构建与转化

内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶(FAD3)是不饱和脂肪酸合成途径中催化十八碳二烯酸[18∶2(9,12)]转化为十八碳三烯酸[18∶3(9,12,15)]的关键酶。通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到LeFAD3的全长cDNA,基因全长为1 184bp,开放阅读框(ORF)为1 134bp,注册号为EU251190。将该基因正反向序列分别插入带有35S-CaMV启动子pBI121表达载体下游,获得正、反义表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化番茄,获得转基因番茄植株。     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。     

油用牡丹脂肪酸脱氢酶基因FAD3的克隆与表达分析

【目的】ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)为植物脂肪酸生物合成途径中的关键酶,通过对油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因结构特征及其在不同组织中的表达模式进行分析,为研究FAD3在油用牡丹‘凤丹’脂肪酸形成过程中的调控提供理论基础。【方法】采用RACE和RT-PCR的方法克隆油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因,用Vector NTI Advance 11软件进行序列分析,BLAST进行同源性比较,并用MEGA7.0的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,利用在线蛋白质分析工具Ex PASy预测FAD3蛋白的基本参数和特性,利用Phyre2预测蛋白质二级和三级结构,并通过实时荧光定量PCR检测该基因在油用牡丹‘凤丹’不同发育期的种子以及不同组织中的特异性表达情况。【结果】获得油用牡丹‘凤丹’脂肪酸脱氢酶FAD3,命名为FAD3(Gen Bank登录号:KX906966)。序列分析表明该基因c DNA序列全长1 723 bp,其中,开放阅读框1 308 bp,编码435个氨基酸,3′端非编码区长287 bp,5′末端非编码区长99 bp,预测成熟蛋白分子量为49.9 k D,理论等电点(p I)为7.42,N端无信号肽,脂肪系数为83.08,不稳定指数35.67,总水平亲水性为-0.222。经FAD3蛋白的二级结构预测,FAD3以α-螺旋、随机卷曲为主,其次是延伸链、β-转角含量较少;多序列比对结果表明,油用牡丹FAD3氨基酸序列含有2个保守结构域,系统发育分析结果显示‘凤丹’与芍药处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Target P亚细胞定位分析得知,FAD3蛋白有3个跨膜区域,可能定位于内质网中发挥功能。组织特异性结果分析表明,FAD3在‘凤丹’的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,雌蕊次之,在雄蕊中表达量最低;不同时期种子中,10 d表达量最高,20 d次之,在60 d中表达量最低。【结论】成功从油用牡丹‘凤丹’中克隆获得FAD3全长c DNA序列,其在‘凤丹’不同组织中呈现出多种表达模式。     

湘油15号芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析

根据GenBank中脂肪酸延长酶基因fae1序列(AY888037)设计了PCR扩增引物,以甘蓝型油菜品种湘油15号总DNA为模板进行扩增,得到了扩增产物.测序结果表明,该片段长度为1 642 bp,经序列分析表明,其氨基酸编码序列为1 425 bp,共编码475个氨基酸.BLAST分析结果表明,湘油15号中的fae1基因与其他芸薹属品系的fae1基因核苷酸同源性在66%～99%之间.氨基酸序列比对结果表明,高芥酸油菜品种fae1在第206位缺失了1个Thr,且甘蓝型油菜比白菜型油菜在羧基末端要多出7～16个氨基酸,这些核苷酸序列差异以及某些关键氨基酸的改变有可能是导致不同油菜品种中芥酸含量变异的原因.     

近红外光谱法在测定油菜籽含油量及脂肪酸组成中的应用

用傅立叶变换近红外技术非破坏性测定油菜籽的油酸、芥酸和含油量,并建立数学模型.内部交叉验证表明:该方法测定上述3个品质参数的定标方程决定系数分别为0.979 2、0.992 4和0.974 9, 均方差依次为1.96、1.56和0.67,与化学测定方法有类似的准确性和精确性.外部检验结果表明,油酸、芥酸和含油量的近红外测定值与化学测定值之间相关系数分别为0.99,0.99和0.97,平均绝对误差和相对误差分别为2.31%、0.29%、0.76%和4.21%、3.40%、1.90%.装样质量对近红外测定值精度影响试验结果表明:当装样质量为0.50 g时,对测定值影响较大;当装样质量为1.00～1.50 g时,对测定结果影响较小;当装样质量大于1.50 g时,近红外测定值与化学测定值基本一致.重复性分析结果表明,近红外光谱分析法重复性好,达到国标要求.近红外光谱分析技术完全可以用来快速、简便、非破坏性测定育种材料,是油菜低世代材料品质筛选的重要手段.