茶尺蠖普通气味结合蛋白(GOBP)的基因克隆与序列分析

以触角总RNA为模板,根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR扩增结合RACE技术克隆获得了茶尺蠖(Ectropis obliqua)普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2基因的cDNA全长序列。分别命名为EoblGOBP1和EoblGOBP2。EoblGOBP1的cDNA全长为1 528 bp,开放阅读框501 bp,编码166个氨基酸残基,预测分子量Mw=18 835.63 D,等电点pI=5.45,cDNA和氨基酸序列在NCBI/GenBank的登录号分别为FJ156732和ACN29680.1。EoblGOBP2的cDNA全长为1 315 bp,开放阅读框405 bp,编码160个氨基酸残基,预测分子量Mw=18 002.75 D,等电点pI=5.32。cDNA和氨基酸序列在NCBI/GenBank的登录号分别为FJ156733和ACN29681.1。两个气味结合蛋白的氨基酸序列中都含有6个保守的半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征,与已报道的鳞翅目昆虫气味结合蛋白的同源性为分别62%～82%和76%～88%。     

茶尺蠖触角高丰度气味结合蛋白EoblOBP9、EoblOBP11的配基结合功能和模式差异研究

茶尺蠖(Ectropis obliqua Prout)是茶园重要的鳞翅目害虫,雄雌成虫能通过嗅觉系统感受和分辨外界环境的化学信息以助于其交尾和产卵地选择等行为.在此过程中,成虫触角高丰度表达的气味结合蛋白(Odorant-binding proteins,OBPs)可能发挥了重要作用.以茶尺蠖成虫触角高丰度表达的两个O...     

化学感受蛋白直系同源基因CSP8在茶尺蠖及近缘种灰茶尺蠖中的表达分析

化学感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)在昆虫化学通讯及其他生理过程中发挥重要功能.茶尺蠖与其近缘种灰茶尺蠖是茶园重要鳞翅目害虫,对我国茶叶的安全生产造成严重危害.研究化学感受蛋白直系同源基因在茶尺蠖两近缘种间的表达,有助于研发同时针对该两种害虫的绿色防控技术.通过荧光定量qRT-PCR分析...     

茶小绿叶蝉危害乌龙茶茶树品种的挥发物分析

为明确茶小绿叶蝉危害不同抗性茶树品种后挥发物的变化,从而为抗虫茶树品种的选育提供依据,本研究选择小绿叶蝉危害虫口密度最大和最小的乌龙茶茶树品种肉桂和铁观音为材料,以GC-MS为研究手段,进行茶树组成型和虫害诱导型挥发物的测定和分析。结果表明,邻异丙基苯甲烷、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、α-法呢烯、γ-萜品烯和3-甲基-2-环己烯-1-酮为铁观音和肉桂的主要组成型挥发物成分。2个品种在健康茶树挥发物的成分组成和各组分的含量上都存在差异。芳樟醇只在铁观音的健康茶梢中被检测到,而十三（碳）烷、乙酸辛酯、十六烷和雪松醇只在肉桂的健康茶梢上检测到。β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯和α-法呢烯在铁观音上的含量远远大于肉桂。另一方面,茶树受小绿叶蝉危害一段时间后,铁观音和肉桂在挥发物组成和含量上产生了较大的变化。二者都释放大量的β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、α-法呢烯和芳樟醇,在危害4 h和8 h的挥发物测定中,2个品种的这些成分较危害前的增加量从1.49倍到41.22倍。此外,茶小绿叶蝉的危害还诱导了新的挥发物的产生,包括(Z)-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯和苯乙醇。(Z)-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯、苯乙醇、β-月桂烯、β-罗勒烯、反式- β-罗勒烯、α-法呢烯和芳樟醇,这10种挥发性物质可能跟茶树的诱导抗性和铁观音的抗虫性有关。     

茶树不同成熟度叶片对茶尺蠖发育适合度的影响

采用室内饲养方法,研究了取食茶树不同成熟度的叶片对茶尺蠖发育与生殖的影响。结果表明,取食嫩叶有利于茶尺蠖产卵量的增加,成叶有利于茶尺蠖幼虫生长发育,老叶则不利于茶尺蠖取食,尤其对低龄幼虫影响更大。从茶尺蠖生命表参数的变化来看,成叶较有利于茶尺蠖种群的发展,老叶上茶尺蠖种群发展最慢。但是,3种叶片均能维持茶尺蠖完成世代循环。不同茶树叶片化学物质含量分析表明,氨基酸、水分含量是影响茶尺蠖生长发育的主要营养因子。相关性分析显示,茶尺蠖不同发育阶段对叶片营养需求有所不同,嫩叶和成叶的营养成分对茶尺蠖发育存在互补的可能。     

基于DDRT-PCR研究茶树对茶尺蠖取食诱导的基因表达谱差异

利用DDRT-PCR技术初步研究了茶树被害虫茶尺蠖取食后基因表达谱差异。结果表明：接头引物A3、A4、A6、A7和A8分别与随机引物R1-R8,R12组合扩增后,总共得到222条差异片段,占总条带数的32.8％。在所鉴定的20个差异片段中,有8个片段序列没有发现同源序列;有5个片段序列与未知功能蛋白相关;其余7个差异表达的片段序列可分为6类,即分别与光合系统II色素蛋白（C15）、非生物抗性诱导蛋白（D22）、糖苷代谢酶（A45）、核酸和蛋白转录调控因子（A12, D63）、生长素调节蛋白（E94）和营养性抗虫蛋白（D73）。其中差异表达片段C15、A45、D22、D73和E94在植物与害虫相互作用相关分子机制研究中首次被发现。     

茶树对茶尺蠖取食危害的补偿光合生理反应研究

利用叶绿素荧光仪和光合测定系统研究了茶树受到害虫茶尺蠖危害后的补偿光合生理变化。结果表明,茶树在受到茶尺蠖危害后的21天内,受害叶片和同株未受害叶片的光系统Ⅱ的光化学效率（Fv／Fm）、光合电子传递速率（ETR）和净光合速率（Pn）的值均高于对照,NPQ明显低于对照,且这种差异在危害后第7天最大,随后逐渐减小。说明茶树受茶尺蠖危害后,诱导产生了补偿光合作用,且补偿能力随时间的推移而变小。此外,茶树在茶尺蠖取食后,气孔导度和蒸腾速率增加。     

茶树挥发物的生态功能与茶树害虫食诱剂研发策略

植物挥发物对调节植物—害虫间关系、害虫种群消长起着重要作用。基于害虫偏好食源挥发物研制的食诱剂（也称“植物源引诱剂”）,是一类重要的害虫绿色防控产品。文章总结了虫害诱导茶树挥发物的释放特征、生态功能,分析了茶树害虫食诱剂研发与应用过程中的经验,并对今后茶树害虫食诱剂研究进行了分析和展望,以期促进茶园害虫绿色防控技术的创新发展。     

瓜实蝇气味结合蛋白基因的克隆及表达谱分析

在气味识别过程中,气味结合蛋白(OBPs)对昆虫的行为反应有重要作用。通过转录组库和NCBI筛选获得瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]OBPs基因序列,进而通过RT-PCR、克隆等方法获取c DNA全长序列,命名为BcucOBP19。结果表明:BcucOBP19基因开放阅读框全长471 bp,编码157个氨基酸,分子量17.5 ku,等电点5.14,具有昆虫OBPs典型的6个保守半胱氨酸位点。BcucOBP19在瓜实蝇各部位均有表达,以15日龄的雌虫触角中表达量最高,在头、腹、翅和前足中表达量较低,且没有显著性差异。     

三级营养关系中茶树间接防御茶尺蠖危害的生化机制

以茶树—茶尺蠖—单白绵绒茧蜂三级营养关系为模式,从寄主选择行为和茶树—条尺蠖交互作用的角度,探讨了茶树借助天敌绒茧蜂间接防御条尺蠖危害的机制。结果表明,茶尺蠖取食茶树,其口腔分泌物作用于损伤部位,致使茶树释放出与完整新梢完全不同的挥发性化合物（互利素）,强化了天敌昆虫（单白绵绒茧蜂）的寄生效率,减轻了茶树的受害程度。其间,茶尺蠖幼虫口腔分泌物中的β-D-葡萄糖甘酶为一使茶树释放挥发性互利素的启动子。初步分析表明,茶树释放挥发性互利素所消耗的光合产物仅占茶树全部光合量的极少部分。     

茶尺蠖潜在飞行能力的研究

为探究茶尺蠖成虫的飞行扩散能力,本研究利用昆虫飞行信息系统,室内测定了茶尺蠖不同日龄、不同性别及交配前后成虫的飞行能力.结果表明,雌雄成虫均以2日龄的飞行能力最强,平均飞行距离分别达9.14 km和8.16 km,一次最远的飞行距离分别为2.56 km和1.93 km.雌成虫的飞行能力在3日龄时显著下降,雌雄成虫的飞行能力仅在3日龄时表现显著差异.交配对2日龄雌雄成虫的飞行能力无显著影响.     

不同地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性差异研究

采集来自浙江、湖南、湖北和江苏省的7个不同地理种群茶尺蠖,用茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）进行室内生物测定,结果表明不同地理种群茶尺蠖对EoNPV敏感性存在明显差异。浙江杭州种群和江苏宜兴种群对EoNPV的敏感性较高,饲毒后11d幼虫全部死亡,致死中浓度（LC₅₀）分别为8.32×10⁴PIB/mL和8.61×10⁴PIB/mL;其他5个地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性较低,饲毒后11d的死亡率均在30%以下,致死中浓度LC₅₀在1.35×10⁷~6.03×10⁷PIB/mL之间;其中敏感性最低的浙江衢州种群和敏感性最高的江苏宜兴种群毒力差异达724.5倍。     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。     

茶树磷转运蛋白基因CsPT4的克隆、亚细胞定位及表达分析

茶园中磷肥的利用效率取决于茶树体内与磷元素吸收、转运及生理利用等相关蛋白的协同调控,而磷转运蛋白(Phosphate transporter proteins,Phts)在此过程中起着关键的调控作用。本研究以茶树品种龙井长叶(Camellia sinensis cv.Longjing-changye)为试验材料,采用同源克隆的方法首次克隆获得茶树磷转运蛋白编码基因Cs Pht1:4(Cs PT4)的全长c DNA。该基因全长1 642 bp,开放阅读框(ORF)1 620 bp(Gen Bank登录号:KY132100),编码539个氨基酸。生物信息学分析显示,Cs PT4基因编码蛋白分子量为59.12 k D,理论等电点(p I)为8.51;具有典型的Pht1家族特性:"6-亲水-6"跨膜结构。亚细胞定位结果显示,该蛋白分布于质膜上,与Softberry软件预测结果一致。荧光定量PCR表明:Cs PT4在正常生长的茶树根、茎、嫩叶、老叶中均有表达,在老叶中的表达量较高,在根部表达量最低。低磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均先上升后下降;根部Cs PT4表达量48 h内各个时间点均高于叶部。缺磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均升高;根部和叶部分别在72 h和48 h达最大值。本研究为茶树响应低磷的分子机制提供了参考。