口蹄疫病毒非结构蛋白VPg1-2、VPg2-3、VPg3基因的克隆、表达及VPg1-2抗体持续时间的研究

【目的】表达口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）非结构蛋白VPg1-2、VPg2-3、VPg3，用于FMDV感染与灭活疫苗动物鉴别诊断和其蛋白功能研究。【方法】对O 型口蹄疫病毒太保毒株3ABC 基因片段中的 VPg1-2 (3B1-2)、VPg2-3 (3B2-3)、VPg3 (3B3)基因进行扩增和亚克隆，并将它们分别插入pGEX-4T-1 表达载体构建了重组表达质粒，经IPTG诱导后，进行Western blotting 分析。以纯化的VPg1-2表达蛋白为抗原建立间接ELISA，对背景清楚的实验牛血清进行检测。【结果】表达的VPg1-2、VPg2-3蛋白可与FMDV阳性血清发生特异性反应，表达的VPg3蛋白没有反应。VPg1-2表达蛋白与对照组（C组）和灭活疫苗反复免疫组（CI组）牛血清均不发生反应，与未免疫直接攻毒组（D组）血清均发生反应，与部分免疫后攻毒组（I组）（4/7）血清发生反应，与部分I组（3/7）血清不发生反应；D组和I组VPg1-2表达蛋白抗体持续时间最长可达90 d以上，最早检出相应抗体的时间为攻毒后第10天。【结论】表达的VPg1-2抗原用于健康牛群、免疫后未感染牛群以及未免疫感染牛群的鉴别诊断的特异性、敏感性达到100%，对免疫后感染牛群进行检测时可能有一定的漏检现象。     

口蹄疫病毒VPg2基因克隆表达及VPg2-ELISA检测抗体评价

 成功亚克隆了口蹄疫病毒（FMDV）太保毒株3ABC中VPg2基因，并将其插入pGEX-4T-1表达载体构建重组表达质粒，Western blotting分析表明，表达的VPg2蛋白与FMDV阳性血清发生反应。以VPg2表达蛋白为抗原建立间接ELISA方法，对背景清楚的试验牛血清进行检测，结果VPg2表达蛋白与空白对照组（C组）和灭活疫苗反复免疫组（CI组）牛血清均不发生反应，与未免疫直接攻毒组（D组）和免疫后攻毒组（I组）血清均发生反应；对D组和I组，VPg2表达蛋白抗体持续时间最长，可达90d，最早呈阳性反应时间为攻毒后第10天。VPg2表达蛋白抗体持续时间与先前测定的3ABC表达蛋白抗体几乎相同。用VPg2-ELISA方法检测2 170份进口阴性牛血清，12份出现假阳性，假阳性率为0.55%，而用3ABC-ELISA方法检测，48份出现假阳性，假阳性率为2.21%。     

新城疫病毒M蛋白通过自身核定位信号介导进入宿主细胞核

通过生物信息学方法预测了新城疫病毒(NDV)基质蛋白(M)的细胞核定位信号(NLS),用Overlap-PCR方法缺失NLS基因,分别构建M和M-ΔNLS EGFP重组质粒,转染单层鸡胚成纤维细胞(DF-1),激光共聚焦观察了M蛋白亚细胞定位。结果表明:M蛋白能进入宿主细胞核中,缺失NLS基因序列之后M蛋白只分布于细胞质中。结论:新城疫病毒M蛋白可以通过其核定位信号进入宿主细胞核。     

鸡蛋花花叶病毒28.5ku移动蛋白基因的克隆与序列分析

鸡蛋花 (Plumeria acutifolia )为热带地区著名的观赏植物 ,受鸡蛋花花叶病毒(frangipani mosaic virus,FMV)感染后 ,其生长发育受到抑制 ,并表现花叶的症状〔1〕。FMV是烟草花叶病毒组 (tobamoviruses)的成员。病毒基因组与 TMV类似 ,为单链正义 RNA。基因组 5′端为帽子结构 ,3′端为 t RNA结构。基因组编码病毒复制、细胞间移动、外壳蛋白等 4个蛋白。其中 2 8.5ku蛋白涉及病毒在细胞间的移动 ,并且与病毒 RNA与植物细胞的胞间连丝相互作用有关〔2〕。目前 ,烟草花叶病毒组的主要成员如 TMV-U1、To MV、PMMV、TMGMV、CGM…     

新城疫病毒NP蛋白的分子生物学特征及其功能

NP蛋白是新城疫病毒核衣壳蛋白的主要结构蛋白,其N端高度保守,与病毒基因组RNA直接结合,保护病毒基因组RNA免受RNA酶的降解.NP蛋白与基因组RNA共同组成NP-RNA复合体,作为复制和转录的模板,具有高度的免疫原性,能够介导细胞免疫作用.NP蛋白在研制特异免疫探针鉴别新城疫、人抗肿瘤以及研发新城疫病毒样颗粒疫苗等新型基因工程疫苗等方面具有广阔的发展前景.     

酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子

小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属马铃薯Y病毒科(Potyviridae),大麦黄花叶病毒属(Bymovirus).该病毒基因组是由两条正义单链RNA1和RNA2构成,共编码10个蛋白,其编码的P2在病毒的复制过程中发挥重要功能.文章构建了小麦cDNA酵母文库,通过共转试...     

小麦黄花叶病毒P3蛋白致病功能域的鉴定和分析

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)大麦黄花叶病毒属(Bymovirus),其基因组由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。先前的研究表明,马铃薯Y病毒组多种病毒编码的保守蛋白P3具有多种功能,在病毒复制、致病性、克服宿主抗性、细胞间移动等方面均具有重要作用,而P3在大麦黄花叶病毒属中是否有类似功能目前还未见报道。本研究利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的本氏烟基因沉默系统,明确了WYMV的P3碳端在本氏烟上具有致病功能域P3-C,但完整的P3则不具有致病能力。进一步移码突变研究表明,P3-C的致病性是由其编码的多肽引起的,而非病毒来源的小干扰RNA介导的宿主基因沉默。同时P3-C的两个跨膜结构域对致病性具有重要作用,单独表达任何一个跨膜结构域P3-C均不能在本氏烟上引起明显症状。     

水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的外壳蛋白(coat protein,CP)参与病毒转录、复制等多个生物学过程。病毒蛋白之间的互作对病毒侵染活性非常重要,在明确RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上,通过构建CP蛋白N端、M区段和C端(CP-N、CP-M和CP-C)的酵母表达载体,利用酵母双杂交系统确定外壳蛋白CP自身互作的活性区段。结果表明,N端和C端第1~81个氨基酸是参与水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性区段。这一研究结果不仅有助于加深理解RSV CP蛋白在病毒基因组稳定、复制过程中的作用,也有助于加深了解RSV、寄主和传播介体之间关系。     

本氏烟组蛋白H4与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus, ToMMV)外壳蛋白(Coat protein, CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay, LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细...     

植物转录后基因沉默抑制蛋白研究进展

转录后基因沉默现象广泛存在于植物、动物和真菌中。在植物中转录后基因沉默现象是对外来病毒入侵的一种防御机制。植物病毒既是转录后基因沉默的起始物、靶目标，又是编码抑制转录后基因沉默的蛋白。已经发现3种病毒抑制子作用于转录后基因沉默的不同阶段：烟草蚀刻病毒蛋白（HC-Pro）作用于转录后基因沉默的持续阶段，产生25nt小RNA的上游和产生沉默信号的下游区域；马铃薯x病毒蛋白（P25）和黄瓜花叶病毒蛋白（CMV2b）作用于转录后基因沉默的信号阶段。     

小麦黄花叶病抗性鉴定及抗性亲本简单重复序列

小麦梭条斑花叶病毒（wheat spindle streak mosaic virus,WSSMV）又名小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus,WYMV）是造成小麦Triticum aestivum减产的重要病害。不同的小麦品种对WYMV病害的抗性表现相当复杂。推广抗性品种是防止WYMV大面积田间发病的有效措施。以从国内外收集到的527个小麦品种/系为材料,对其WYMV抗性进行了病圃鉴定,筛选抗性稳定的品种/系,并以其中推广面积较大的WYMV抗性和敏感品种为亲本筛选在抗性和敏感亲本间具有多态性的简单重复序列（SSR）标记。结果表明:527个候选材料中只有10个品种/系的抗性相对比较稳定。以其中3个推广面积较大的WYMV抗性品种丰抗1号T. aestivum Fengkang 1,石家庄72 T. aestivum Shijiazhuang 72,郑麦9023 T. aestivum Zhengmai 9023以及2个推广面积较大的WYMV敏感型品种扬麦158 T. aestivum Yangmai 158和烟农22 T. aestivum Yangnong 22为亲本,筛选在抗性和敏感亲本间具有多态性的SSR标记。结果表明:丰抗1号/扬麦158和石家庄72/扬麦158间的简单重复序列多态性最大,分别为64.0%和63.3%。因此,以WYMV抗性品种丰抗1号和石家庄72,以及WYMV敏感品种扬麦158为亲本材料构建作图群体更有利于利用分子标记对控制WYMV抗性数量性状位点（QTLs）进行精细定位和目标基因的图位克隆。图2表3参17     

小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测

用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。     

Responses of Some American, European and Japanese Wheat Cultivars to Soil-Borne Wheat Viruses in China

Wheat seeds of 109 cultivars from USA, Europe and Japan were sown in experiments at seven sites in different provinces of China for one or two seasons. Five of the sites were infested with the bymovirus wheat yellow mosaic virus (WYMV) and two jointly with WYMV and the furovirus Chinese wheat mosaic virus (CWMV). Disease symptoms were assessed visually and leaf samples were tested for virus(es) by ELISA. At least 29 cultivars were resistant to WYMV at the sites where only this virus was present but all the cultivars were severely infected at Rongcheng (Shandong Province) where CWMV was mixed with WYMV. There was evidence that the presence of CWMV assisted infection by WYMV and also resulted in more severe symptoms.At the mixed site in Yantai, Shandong Province, symptoms were mild and many cultivars had symptomless infection. Of the two strains of WYMV identified in Japan, the Chinese sites seem to be most similar to the type isolated, WYMV-T. Eleven cultivars seemed to be susceptible to WYMV only at Loutian (Hubei Province),suggesting that the virus at this site would be worth studying further.     

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa 的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5′端和3′端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL C2X中构建重组表达载体MBP P2N,MBP P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP P2N和MBP P2C融合蛋白。MBP P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。     

山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测,从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为97.6%～98.3%,氨基酸一致率为98.3%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中,这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起,其中枣庄分离物和河南分离物(FR828007)亲缘关系更近。     

驻马店地区小麦黄花叶病害病原鉴定与品种抗性评价

为了解驻马店地区小麦黄花叶病病毒分离物的类型及该地区主要推广小麦品种对小麦黄花叶病的抗性表现,对驻马店地区13个不同地点同一小麦品种上病毒分离物进行鉴定,并在同一田间试验条件下,对驻马店地区主要推广的12个小麦品种进行田间抗性评价。结果表明,随机选取的13个地点中有4个地点的样品中检测出小麦黄花叶病毒(WYMV),占总样品的30.8%,所有地点均未检测到中国小麦花叶病毒(CWMV)。在供试的12个小麦品种中,豫农416和衡观35表现为高抗,占供试品种的16.7%;泛麦8号和华育198表现为中抗或中感,占供试品种的16.7%;另外8个品种则表现为感病,占供试品种的66.6%。不同小麦品种在病圃区的产量及产量构成因素存在较大差异。以上结果表明,WYMV在驻马店地区有一定范围的分布,暂未检测到CWMV;该地区主推的小麦品种中豫农416和衡观35对小麦黄花叶病具有一定的抗性。     

四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是斐济病毒属的成员之一,可侵染玉米和水稻等作物,给亚洲地区的田间生产带来严重的损失。RBSDV有10条双链RNA(double strand RNA, dsRNA)基因组,编码12个蛋白。其中6个蛋白是病毒粒子的结构成分(P1,P2,P3,P4,P8,P10),6个非结构蛋白分别为P5,P6,P7\|1,P7\|2,P9\|1,P9\|2。在非结构蛋白中,P5,P6和P9\|1已被证实参与形成毒质结构,P7\|1被认为可在细胞质中形成类似管状的结构作为病毒胞间扩散的通道,P7\|2和P9\|2的功能目前尚不明确。文章采用Pull\|Down和液相色谱—质谱联用(LC\|MS/MS)等技术来鉴定水稻蛋白(日本晴)与P7\|2蛋白间可能存在的互作关系。通过Pull\|Down实验分析,发现有4种水稻蛋白可与P7\|2相结合,其中2个蛋白为转录相关蛋白,1个为氨基转移酶,还有1个为假定的分子伴侣60前体。实时荧光定量PCR分析显示,感病寄主中的转录相关蛋白和假定的分子伴侣60前体的表达量上调,而氨基转移酶的表达量降低。     

Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution

The sequence of the entire RNA genome of the type flavivirus, yellow fever virus, has been obtained. Inspection of this sequence reveals a single long open reading frame of 10,233 nucleotides, which could encode a polypeptide of 3411 amino acids. The structural proteins are found within the amino-terminal 780 residues of this polyprotein; the remainder of the open reading frame consists of nonstructural viral polypeptides. This genome organization implies that mature viral proteins are produced by posttranslational cleavage of a polyprotein precursor and has implications for flavivirus RNA replication and for the evolutionary relation of this virus family to other RNA viruses.