cDNA文库与RACE方法结合克隆马铃薯DnaJ -like基因全长cDNA

 以青枯病菌小种3号(生化变种2) PO41诱导24 h和48 h的马铃薯抗青枯病基因型ED13叶片为材料, 应用SMART技术构建了一个富集青枯病抗性相关基因的cDNA文库。继而利用RACE技术与该cDNA文库相结合克隆了一个马铃薯分子伴侣基因的全长cDNA。该cDNA长735 bp, 5′端有25 bp的非翻译区, 3′端具有完整的polyA 尾, 包含一个编码177 个氨基酸的完整开放阅读框架( GenBank 登录号:DQ885360) 。该分子伴侣基因与拟南芥DnaJ-like 20的部分核苷酸序列具有84%的一致性, 与其编码的氨基酸序列具有59%的一致性, 暂命名为StDnaJ。目前在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。半定量RTPCR结果表明, 该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节, 可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能。     

番荔枝开花调控转录因子基因AsLEAFY的克隆与表达分析

利用同源克隆和RACE-PCR获得番荔枝LEAFY基因的全长cDNA序列,命名为AsLEAFY,Gen Bank登录号为KP866145。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsLEAFY基因长为1 236 bp,编码411个氨基酸,该氨基酸序列含有5′-N端脯氨酸富集区和中央酸性区,具有LEAFY(FLO)家族的典型结构特征。同源分析表明,该氨基酸序列与多种木本植物LEAFY类蛋白的同源性较高。进化树分析表明AsLEAFY与木本植物的亲缘关系高于草本植物。实时定量PCR结果表明,AsLEAFY在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,在初期的花芽中表达量最高,在不同组织器官中表达量存在差异,在枝条去叶后的腋芽中的表达量最高。推测该基因在番荔枝花器官形成初期发挥重要作用。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。     

刺五加鲨烯合酶基因2 cDNA的克隆与蛋白结构分析

采用RT-PCR和RACE法克隆了刺五加鲨烯合酶基因2(squalene synthase gene 2,SS2)cDNA的全长序列(GenBank登录号:JN714465)。该序列全长1 463bp,其中5’端非翻译区长10bp,3’端非翻译区长208bp,开放阅读框长1 245bp,编码414个氨基酸。该蛋白具有1个Trans_IPPS_HH保守区域、2个鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶特异性识别区域及2个跨膜区。氨基酸序列比对结果表明,该蛋白与五加科其它植物SS的一致性均大于90%,与刺五加SS1的一致性为91.79%。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

白菜β-1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板, 采用RT2PCR 技术, 获得了1032 bp 的β- 1,3- 葡聚糖酶基因的cDNA 序列。序列分析表明, 克隆的β- 1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA 序列编码343 个氨基酸, 与芜菁bg1 基因具有98 %的同源性, 与拟南芥bg2 基因具有84%的同源性。在GenBank 中登录号为AY395720 。     

基于EST数据库的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板,根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物,分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端,序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2 208 bp,命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1 536 bp完整的开放读码框(ORF),其5’与3’末端非翻译区分别为268 bp和376 bp。其中,3’末端含有28 bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸,具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中,Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。     

柑橘钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析

 以温州蜜柑(Citrus unshiu Marc. ) 幼果cDNA第1链为模板, 参照大麦钙调蛋白基因序列(Accession No. M27303) 合成5p端和3p端引物, 以PCR的方法扩增得到柑橘钙调蛋白cDNA, 将其克隆到PMD182T载体上并进行测序。序列分析表明, 柑橘钙调蛋白cDNA全长453 bp, 共编码148个氨基酸, 与大麦和大豆钙调蛋白基因的同源性均高达83%以上, 所编码氨基酸序列同源性达97%以上。以该cDNA作探针进行点杂交, 得到良好的杂交信号。     

白菜GLDH 基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜品种‘苏州青’ cDNA 为模板, 采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术, 获得了L - 半乳糖酸- 1, 4 - 内酯脱氢酶(EC 1.3.2.3, GLDH) 基因cDNA 2 034 bp全长序列。序列分析表明, GLDH基因cDNA序列编码601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜GLDH基因具有98%的同源性, 与拟南芥GLDH基因具有90%的同源性。该基因在GenBank中登录号为AY899298。     

菜薹花芽分化及BrcuFLC基因的克隆与表达

通过制作石蜡切片研究了菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. utilis Tsen et Lee)早熟品种‘油青49’和晚熟品种‘油青甜菜心80天’的花芽分化过程,结果表明,当展开2~3片真叶时花芽分化开始启动。用已报道的拟南芥Flowering locus C (FLC) 基因和FRIGIDA (FRI) 基因的保守区域设计引物,通过RT-PCR的方法从两个菜薹品种中均克隆得到了两个决定开花的关键基因,并命名为BrcuFLC (GenBank登录号为EF138603)和BrcuFRI (GenBank登录号为EU700362)。半定量式RT-PCR表达分析表明, BrcuFLC基因在早、晚熟菜薹品种的不同发育时期表达存在差异,表达量随真叶数增加而逐步减少,但在晚熟品种中BrcuFLC表达量降低幅度小;BrcuFRI则在早、晚熟品种的所有阶段表达都较低。BrcuFLC在菜薹不同部位表达的情况不同,在茎、叶中的表达强,花次之,根中表达较弱;而BrcuFRI在早、晚熟品种根中的表达量明显高于其它3个部位。     

葡萄转录因子VpSBP12的克隆及功能分析

以华东葡萄‘白河-35-1’为试材,依据葡萄全基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr),利用同源序列比对结果设计引物,克隆获得VpSBP12基因的DNA和cDNA序列,并分析其序列特征和表达特性,以期阐明其在葡萄抗盐胁迫中的作用,为葡萄抗逆育种提供参考依据。结果表明:VpSBP12基因DNA全长2 907bp,其中含有3个外显子和2个内含子;该基因的完整开放阅读框序列全长1 137bp,编码379个氨基酸,其中包括一个含有双向核定位信号的高度保守SBP结构域。经过亚细胞定位和转录活性分析表明,该基因可以定位到核里,且具有转录激活活性。构建过量表达载体将VpSBP12转化拟南芥后发现,转基因株系在盐胁迫培养基上的萌发率及根长显著高于野生对照。表明VpSBP12基因在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫的能力。     

辣椒高赖氨酸蛋白基因Cflr全长cDNA的克隆及其组织表达特征

为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。     

大叶补血草Na+/H+ 逆向转运蛋白基因( SOS1)的克隆与序列分析

 用RT-PCR及RACE方法从盐生植物大叶补血草Limonium gmelinii (Willd. ) Kuntze中分离出Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白基因的cDNA (LgSOS1, GenBank登录号EU780458) , LgSOS1的cDNA全长为3 910bp, 5′非翻译区为79 bp, 3′非翻译区为376 bp, 开放阅读框为3 455 bp, 编码1 151个氨基酸, 推测分子量为126 kD。氨基酸同源性分析表明, LgSOS1与冰叶午时花、沙拐枣、番茄、盐芥和拟南芥质膜型Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白的一致性分别为69.02%, 64.42% , 61.96% , 60.12%和59.62%。预测分析表明, LgSOS1有12个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白与质膜型的Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白的亲缘关系较近, 与液泡型的Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。     

大白菜温度敏感雄性不育育性转化相关XET基因的电子克隆

以从大白菜温敏雄性育性转化相关基因差异表达的分析中获得的EST-58为标签,采用电子克隆的方法对其进行延伸,并对电子克隆的结果进行RT-PCR验证,结果表明:电子克隆到1个由1197bp核苷酸组成的序列,该序列具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为292个氨基酸。经RT-PCR扩增,连续样品间EST-58表达的带型变化趋势与cDNA-AFLP的差异显示情况一致,且RT-PCR获得的序列与电子克隆的序列一致性达98%。用该序列在GenBank数据库中进行blastX同源性分析,确定该序列为大白菜的XET基因(GenBank登陆号为EU579461)。     

马铃薯C-8,7甾醇异构酶基因(StSI1) cDNA克隆及表达

 以拟南芥C-8, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索GenBank数据库, 对高度同源的马铃薯EST序列进行拼接、引物设计和RT2PCR扩增, 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯C-8, 7甾醇异构酶基因(StSI1) 的全长cDNA序列。序列分析结果显示, StSI1全长886 bp, 包含59 bp的5′非编码序列、161 bp的3′非编码序列和一个长度为666 bp编码221个氨基酸的开放阅读框, 分子量约为25 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白的N端含有一个长度由35个氨基酸残基组成的信号肽, C端成熟肽区域含有典型的类EBP结合域。氨基酸比对分析表明, StSI1与已知C-8,7甾醇异构酶同源性介于32.9% ～61.3%之间, 与拟南芥AtSI1相似性最(61.3% ) 。RT-PCR 表达谱分析显示, StSI1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均能表达, 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。