猪PRRSV云南分离株主要蛋白基因克隆及序列分析

采用RT-PCR技术,分别对PRRSV云南分离株-YN株编码GP3、GP5、M蛋白的基因进行扩增,获得764、602、524 bp特异性目的片段,经纯化后,克隆至pMD18-T载体中,分别进行序列测定与分析。结果表明,云南PRRSV与已知代表毒株核苷酸序列同源性分别为89.72%～98.80%;遗传进化分析表明,云南分离株与HB-2(sh)/2002、CH-1a等毒株关系最近,与VR-2332、respPRRS mlv等同属一个大分支,而与JXA1、GD、NM1等毒株处于不同的分支。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5蛋白ORF5基因的克隆与序列分析

为揭示广东地区猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可能的流行规律,本研究采用RT-PCR的方法扩增5株来自广东地区猪场临床样品的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)分离株的GP5蛋白ORF5基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较。结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株与美洲型参考株(VR-2332) 的核苷酸序列同源性分别为88.8%、99.5%、88.7%、88.7%和83.5%。系统进化树分析结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株均属于美洲型。以上结果为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据, 同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。     

PRRSV广西分离株GXYL-1403全基因克隆与序列分析

对本实验室所分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株GXYL-1403进行全基因组克隆和序列分析。参考已发表的扩增全长PRRSV序列的13对特异性引物,用RT-PCR方法对病毒基因组进行分段扩增。将扩增得到的PCR片段克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。通过软件对所扩增序列进行拼接,获得GXYL-1403的全长序列,并对GXYL-1403进行比较和遗传进化分析。结果表明GXYL1403株基因序列全长为15 018bp,与国内外多株PRRSV毒株进行同源性比较发现,与VR-2332的相似性为89.1%,与TJ、JXA1、HEB1、HUB1、HUB2、TP株同源性达到了97.9%~98.1%。另外,GXYL-1403分离株nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别重要的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游出现了连续74个氨基酸的缺失。遗传进化分析发现美洲型PRRSV主要分为3个亚群,GXYL-1403跟高致病性PRRSV毒株属于同一分支,证实了GXYL-1403株为美洲型PRRSV毒株。     

4株PRRSV GP5蛋白编码序列的序列测定和特性分析

针对PRRSV ORF5基因组设计了1对特异性引物,利用RT-PCR的方法,对在南方地区分离的4株PRRSV ORF5基因进行了基因扩增,克隆到pMD18-T载体后测序,获得了4株PRRSV ORF5基因全长603bp的核苷酸序列。利用生物信息学软件对4株PRRSV ORF5基因序列进行了遗传进化分析,结果显示GD1、GD2、GD3、GD4株与美洲型参考株(VR-2332)的核苷酸序列同源性分别为87.1%、87.2%、87.1%和86.9%。利用系统进化树分析表明GD1、GD2、GD3、GD4株均属于美洲型。进一步采用序列分析软件对病毒结构蛋白推导糖基化位点比较,结果表明不同毒株GP5糖基化位点在基序和位置上均有所不同,这可能与毒株的毒力、免疫原性的差异相关,这些为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。     

PRRSV河北地方分离株ORF5基因序列分析

为了分析河北秦皇岛和唐山部分地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因变异情况,对采集自秦唐部分地区在2009年的临床发病猪肺组织,提取其RNA,通过RT-PCR扩增样本中PRRSV的ORF5全序列,并对其进行生物信息学分析.应用DNA Star软件分析序列,系统进化分析表明,它们与国内2006年-20...     

PRRSV福建株ORF5基因克隆与序列分析

猪繁殖与呼吸综合征,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主的一种严重的病毒性疾病。PRRSV属于尼多目动脉炎病毒科动脉炎病毒属,是含有囊膜的单股正链RNA病毒。PRRSV基因组长约15kb,含9个开放阅读框（ORF）,其中0RF2-7编码病毒的结构蛋白。     

PRRSV辽宁株N蛋白基因的克隆及序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因全长cDNA,结果表明,该分离株N基因cDNA编码区长372bp,可编码123个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,核苷酸同源性分别为92.2%和27.2%,推测该辽宁分离株属于美洲型。     

PRRSV ZQ-GD-2010株的分离及ORF5和ORF7基因的序列分析

为了给研制基因工程疫苗选取毒株奠定基础,研究采集广东肇庆某猪场疑似患高热症猪的病料,通过RT-PCR检测、病毒分离传代,证实分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为ZQ-GD-2010株,并对其ORF5和ORF7基因进行序列测定,绘制遗传进化树。结果表明:该毒株为美洲型,其ORF5和ORF7基因核苷酸与近年来我国分离到的美洲型毒株的相似性为96%～100%,而与欧洲型毒株LV株的相似性仅为58.9%～62.8%;其与2007—2009年国内分离株的遗传演化关系较近。     

抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);经间接ELISA鉴定,单抗52-C为IgG2a亚型;腹水效价为100×27;与伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应;不能中和PRRSV.以表达的GP5不同突变体为抗原经间接ELISA和Western blot证实,单克隆抗体52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区.     

PRRSV流行株Nsp2、ORF5和ORF3基因序列的分析

采用RT-PCR方法扩增2006年--2007年从江西、湖南、海南、广东等4省的不同猪场病猪体内分离的11株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因,并进行序列分析。结果表明,11个PRRSV流行株的Nsp2均发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1毒株相同;11个PRRSV流行株的ORF5、ORF3基因和JXA1相应序列的核苷酸同源性分别为99．2％～99．8％、99．1％～99．6％,氨基酸同源性分别为98．0％～99．5％、98．4％～99．6％;11个PRRSV流行株之间ORF5基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．8％～100．0oA、98．0oA～100．0％,其中5个流行株的ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．0％～99．6％、98．8％～99．69,6。根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这11个PRRSV流行株与JXA1株的亲缘关系很近。     

杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒分离及其ORF6、ORF7基因的序列分析

试验旨在研究杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 辽宁分离株的遗传变异情况及分子生物学特征.用Marc-145细胞从辽宁某杂交野猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)病猪血液中分离到1株病毒,该分离毒株经Marc-145细胞6次传代后出现稳定的细胞病变,采用RT-PCR方法对分离病毒进行ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,并与已知序列毒株的相应片段进行同源性比对.结果表明,分离毒株的ORF6、ORF7基因与国内外美洲型毒株的核苷酸同源性分别为96.0%～100.0%、94.5%～99.4%;氨基酸同源性分别为89.6%～100.0%、87.3%～98.7%;与欧洲型代表毒株LV的ORF6、ORF7基因差异较大,核苷酸同源性分别为70.4%、70.1%,氨基酸同源性分别为48.8%、49.7%.推测辽宁杂交野猪体内分离毒株在基因型上属于美洲型毒株.     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

两株高致病性PRRSV湖北分离株ORF5与Nsp2基因序列分析

2013年从湖北两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,接种Marc-145细胞,可致明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HBHS株和HBXN株)。采用RTPCR方法,对ORF5基因序列和Nsp2基因部分序列进行扩增并测序,并用DNA MAN软件将测序结果与国内外发表的13株参考毒株进行比对分析。结果显示,2株分离株Nsp2基因与国内高致病性JXA1、GD2007、GD2008毒株的氨基酸同源性很高,介于98.5%~99.5%;且该基因与国内其他变异株有完全一致的缺失特征;ORF5基因与国内高致病性毒株的氨基酸同源性为98.1%~99.5%,且系统进化树遗传距离很近,同处一个基因群中,而与CH-1a等经典毒株较远。这两株分离株均属于PRRSV美洲型变异株,此结论为该病的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州PT分离株Nsp2基因克隆及序列变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州PT分离株Nsp2基因序列特征,选择PRRSV JXA1株Nsp2基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV贵州PT分离株Nsp2基因片段,克隆至pMD18-T载体并测序,应用DNAStar、PSORTⅡ、TMHMM、MLRC等软件对Nsp2序列的理化参数、同源性、亲水性、表面可及性、抗原性和亚细胞定位等进行分析和预测。结果显示,该基因cDNA长588 bp,蛋白理论分子质量为21.5674 ku,理论pI值为5.02,为不稳定蛋白,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明该蛋白极有可能位于细胞核,其Nsp2基因与所选18个毒株相应片段的同源性为80.0%~99.8%。预测Nsp2蛋白具有良好的抗原性,在PRRSV的流行过程中,Nsp2基因不断发生遗传变异,产生新的变异序列。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达

本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。