脂肪因子Chemerin对牛卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的影响

[目的]本试验旨在探讨脂肪因子Chemerin在牛卵巢颗粒细胞凋亡与自噬中的作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞并用重组Chemerin蛋白(0.2μg·mL~(-1))处理24 h,采用流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡,通过免疫荧光检测细胞中活性氧(ROS)含量变化,测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR分析凋亡与自噬相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、P62和Atg7 mRNA表达,Western blot技术检测凋亡与自噬相关蛋白表达情况。[结果]与对照组相比,Chemerin处理卵巢颗粒细胞后,细胞中ROS和MDA含量显著上升(P0.05),SOD和GSH-px活性极显著降低(P0.01)。凋亡相关基因Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平显著升高,P62和Atg7 mRNA等的表达也显著上调(P0.05)。[结论]Chemerin可通过调控相关基因的表达诱导牛卵巢颗粒细胞凋亡并伴随自噬的发生。     

过氧化氢诱导猪卵巢颗粒细胞自噬及其对凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。[方法]采用流式细胞术和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测不同浓度(0、50、100和150μmol·L~(-1))过氧化氢处理12 h对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响;Western-blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3,包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)和自噬相关蛋白P62/SQSTM1的表达量变化,转染GFP-LC3质粒检测自噬体的数量;利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)提前4 h抑制自噬后再氧化应激12 h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,CCK8检测细胞活力。[结果]氧化应激12 h后,细胞活力随过氧化氢浓度提高显著降低,凋亡率显著上升。在氧化应激前6 h LC3-Ⅱ相对表达量先增加后减少,P62的相对表达量先减少再增加;转染GFP-LC3质粒后,自噬体数量极显著上调,6 h后显著下降,上述结果表明在氧化应激早期自噬增加,持续氧化应激自噬受到抑制。若提前4 h用3-MA抑制自噬,再用过氧化氢处理12 h,抑制自噬后细胞凋亡率较单独氧化应激组显著下降,细胞活力也显著上升。[结论]氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡和早期自噬,若抑制早期自噬,凋亡率会下降。     

内质网应激在肺泡上皮间质转分化发生中的作用

目的 探讨衣霉素诱导的内质网应激在肺泡上皮细胞-间质转分化(EMT)中的影响及作用机制.方法 以质量浓度为1.25、2.5、5.0 mg/L的衣霉素(TM)分别处理人肺腺癌上皮细胞A549 24 h,MTT法检测细胞活力;RT-PCR和免疫印迹法检测GRP78、CHOP、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、Smad2/3、转录因子Snail的表达;以5μg/L TGF-β1分别处理A549细胞24 h或48h后,免疫印迹法检测GRP78和p-elF2α的表达.结果 1.25 mg/L的TM处理A549细胞24 h后,GRP78 mRNA和蛋白表达升高,CHOPmRNA表达上调;E-cadherin蛋白表达下降,Smad2/3活化,Snail表达上调.而TGF-β1处理A549 24 h,GRP78和p-elF2α表达均上调.结论 衣霉素诱导的内质网应激可介导A549细胞发生EMT,同时EMT发生过程中伴随着内质网应激的发生.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对IPEC-J2细胞增殖、凋亡和屏障功能的影响及其自噬机制

[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对体外培养的仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖、凋亡和屏障功能的影响,探讨DON的肠道毒性作用及相关机制。[方法]以不同浓度(0、0.5、1、2、4、8、和16μmol·L~(-1))DON处理IPEC-J2细胞24 h后,采用MTT、Hoechst 33258、Western blot、Millipore-ERS和IFA法检测DON对IPEC-J2细胞增殖、凋亡、屏障功能和自噬水平的影响;在4μmol·L~(-1) DON处理组添加自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)来提高细胞的自噬水平,用上述方法检测Rapa对DON引起的IPEC-J2细胞增殖毒性、凋亡和屏障功能的影响。[结果]与对照组相比,当DON浓度为4、8和16μmol·L~(-1)时,细胞活性显著(P0.05)或极显著(P0.01)下降。4和8μmol·L~(-1) DON处理凋亡细胞数量和凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3表达显著增加(P0.01),细胞跨膜电阻(TEER)值和紧密连接蛋白Occludin表达显著下降(P0.05),自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Atg5表达显著下降(P0.05)。添加Rapa可以显著缓解DON引起的细胞毒性、凋亡和屏障功能障碍。[结论]DON通过抑制自噬引起IPEC-J2细胞增殖下降、凋亡增加和屏障功能障碍。     

Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响

为明确Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的作用,采用荧光定量PCR和ELISA方法研究了Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果表明:Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞的孕酮分泌有促进作用,且在一定范围内呈剂量依赖性。100 nmol/L Kisspeptin-10(Kp-10)处理颗粒细胞24 h后,显著增加了孕酮的分泌(P0.05),而10 nmol/L和1 000 nmol/L Kp-10处理组对孕酮的分泌无显著影响(P0.05)。100 nmol/L Kp-10可显著提高孕酮合成的关键基因3β-HSD和St AR的mRNA表达水平(P0.01)。研究结果提示,Kisspeptin可促进牛卵巢颗粒细胞孕酮的分泌,推测这一作用可能通过上调孕酮合成关键基因表达来实现。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导PC12细胞凋亡及对相关基因Bcl-2、Bax、Bid mRNA和蛋白cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9表达水平的影响。[方法]用不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·m L~(-1))对PC12细胞染毒24 h,采用透射电镜观察、流式细胞术、荧光定量PCR、Western-blot等方法,研究DON对PC12细胞的超微结构、凋亡率、凋亡相关基因及蛋白表达的影响。[结果]不同浓度的DON均可诱导细胞凋亡,各试验组细胞凋亡率均极显著高于对照组(P0.01),并随着染毒剂量的增加而升高,在1 000 ng·m L~(-1)时达到峰值;与对照组相比,各试验组Bax mRNA表达水平和Bax/Bcl-2值均极显著增加(P0.01),Bcl-2 mRNA表达水平在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01),而Bid mRNA表达水平在DON浓度超过250 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01);Western-blot检测结果显示,各试验组cleaved-Caspase 9蛋白表达量均极显著高于对照组(P0.01),而cleaved-Caspase 3蛋白表达量在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著增加。[结论]DON能够诱导PC12细胞发生凋亡,凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bid及蛋白Caspase3、Caspase9等参与了DON诱导PC12细胞凋亡的调控。     

产PVL金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞内质网应激和自噬的影响

【目的】研究产PV-杀白细胞素（Panton Valentine leukocidin,PVL）金黄色葡萄球菌ATCC49775（产PVL标准菌株）、ΔPVL 49775（PVL基因缺失株）以及体外重组PVL（rPVL）对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）内质网应激和自噬的影响,为系统阐述金黄色葡萄球菌及PVL对BMECs损伤的分子机制奠定基础。【方法】用感染复数（MOI）为30的金黄色葡萄球菌菌株ATCC49775和ΔPVL 49775感染BMECs,于感染后3和6 h取样;用100 ng/mL rPVL处理BMECs,于处理后1,3和6 h取样;以未处理的BMECs为对照（CK）。用免疫荧光法检测样品BMECs细胞的自噬体荧光强度;提取样品细胞的总蛋白,以GADPH为内参蛋白,采用Western blot法检测各处理组内质网应激相关蛋白（CHOP和GRP78）和自噬相关蛋白（LC3 Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62）的相对表达量。【结果】ATCC49775、ΔPVL 49775感染后不同时间,BMECs自噬体荧光强度均极显著（P＜0.01）高于CK,内质网应激相关蛋白（CHOP和GRP78）和自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62）的表达水平也大多显著(P<0.05)或极显著（P＜0.01）高于CK;同一处理时间下, ATCC49775感染组自噬体荧光强度和相关蛋白表达水平均显著(P<0.05)或极显著（P＜0.01）高于ΔPVL49775感染组。 rPVL处理后不同时间,BMECs的自噬体荧光强度均极显著（P＜0.01）高于CK,内质网应激和自噬相关蛋白的表达水平大多极显著（P＜0.01）高于CK。【结论】产PVL金黄色葡萄球菌ATCC49775、ΔPVL 49775以及rPVL均加剧了BMECs的内质网应激和自噬,说明PVL在金黄色葡萄球菌感染BMECs的过程中有重要作用。     

甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及增殖的影响

[目的]本试验旨在探究甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及增殖的影响。[方法]首先采用免疫组化法鉴定甲状腺素受体(TRα/β)在猪卵巢组织的表达情况,随后体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,选取低(10-8mol·L~(-1))、中(10-7mol·L~(-1))、高(10-6mol·L~(-1))3种浓度的甲状腺素(T4)孵育24 h,采用酶联免疫法检测细胞培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,并采用蛋白印迹法检测颗粒细胞内激素合成相关酶蛋白(3β-HSD、CYP19)的表达情况。采用MTT法检测各浓度甲状腺素对细胞活力的影响,利用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光染色验证不同浓度甲状腺素对颗粒细胞增殖的影响。[结果]免疫组化结果显示:TRα/β在猪卵巢不同发育阶段卵泡的颗粒细胞、膜细胞中有广泛表达,在卵母细胞的胞质中也有分布,在闭锁卵泡中也见明显表达。猪卵巢原代颗粒细胞经甲状腺素处理后,细胞培养液中的孕酮和雌激素水平都显著低于空白对照组(P0.05),并且各剂量处理组间孕酮呈现出剂量依赖性降低趋势;雌激素在低浓度和高浓度甲状腺素处理组较中浓度处理组高。蛋白免疫印迹结果显示:与对照组相比,3β-HSD和CYP19蛋白在较高浓度甲状腺素(10-7和10-6mol·L~(-1))处理组的表达量均显著降低(P0.05);而在低浓度甲状腺素(10-8mol·L~(-1))处理组,CYP19蛋白表达量显著降低(P0.05),但3β-HSD蛋白表达无显著差异。此外,MTT细胞毒性和增殖试剂盒检测结果显示:不同浓度甲状腺素处理并不影响细胞活力,这与PCNA免疫荧光强度统计结果一致,进一步证实了甲状腺素对原代颗粒细胞增殖没有影响。[结论]甲状腺素能够作用于卵巢颗粒细胞,干扰类固醇激素的合成,其作用机制可能是通过改变激素合成相关蛋白3β-HSD和CYP19的表达来完成的。而甲状腺素对颗粒细胞激素合成的干扰效应并不影响细胞增殖状态。     

热应激通过钙信号调控湖羊卵巢颗粒细胞凋亡和雌激素合成

热应激严重影响动物的繁殖性能,但热应激是如何通过调控绵羊卵巢颗粒细胞功能进而调控绵羊繁殖的相关研究较少。本研究以湖羊卵巢颗粒细胞为研究对象,利用Real-time PCR、流式细胞技术、Western blot、ELISA等方法探讨热应激对湖羊卵巢颗粒细胞钙信号通路、细胞凋亡和雌激素合成的影响。结果表明,热应激后,湖羊卵巢颗粒细胞中钙离子浓度显著上升(P<0.05),钙离子信号通路中相关基因CACNA1B、CACNA1C、RYR1、CAMK2表达量显著升高,线粒体分裂蛋白FIS1表达量显著上升,促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白代表基因BCL2 mRNA表达量比值(BAX/BCL2)显著上升,细胞凋亡率增加;雌二醇合成关键酶CYP19A1表达量显著下调,雌二醇含量显著下降(P<0.05)。热应激卵巢颗粒细胞中加入钙离子螯合剂(BAPTA-AM)明显降低钙离子浓度,同时减少细胞凋亡,缓解热应激造成的卵巢颗粒细胞雌二醇含量下调。综上表明,热应激打开了湖羊卵巢颗粒细胞膜电压门控钙离子通道和内质网膜上钙离子释放通道,导致细胞质中钙离子浓度上升,促进卵巢颗粒细胞凋亡,引起雌二醇...     

自噬对DON诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响

[目的]本试验旨在研究自噬对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响。[方法]以不同质量浓度DON(0,125,250,500,1 000和2 000 ng·mL~(-1))处理对数生长期仔猪海马神经细胞24 h后,采用倒置显微镜、透射电镜观察DON对仔猪海马神经细胞形态和超微结构的影响;采用p EGFP-LC3质粒瞬时转染细胞,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的分布情况;采用Western blot检测DON对仔猪海马神经细胞自噬标志性蛋白LC3的表达;通过添加自噬激活剂雷帕霉素(RAP)和自噬抑制剂氯喹(CQ)来升高和降低细胞的自噬水平,CCK-8法检测细胞的存活率。[结果]不同质量浓度的DON均可诱导细胞自噬,自噬水平随着DON浓度的增加先上升后下降,在1 000 ng·mL~(-1)时达到峰值。与对照组相比,DON可显著抑制细胞存活率并诱导细胞发生明显的形态学变化,并呈剂量依赖性;随着DON浓度的升高,细胞LC3-Ⅱ含量先上升后下降,1 000 ng·mL~(-1)时,LC3-Ⅱ含量最高,差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。与DON处理组相比,自噬水平的上升显著提高细胞活性(P0.05),而自噬水平的下降显著降低细胞活性(P0.05)。[结论]DON可以引起仔猪海马神经细胞自噬水平的上升,激活的自噬对DON导致的细胞损伤具有一定的保护作用。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞自噬的影响

【目的】研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对PC12细胞自噬的影响。【方法】以不同质量浓度(0(CK),125,250,500,1 000和2 000ng/mL)的DON处理PC12细胞24h后,采用倒置显微镜、透射电镜、免疫荧光、荧光定量PCR、Western-blot等技术,研究DON对PC12细胞形态和超微结构、LC3聚点率及自噬相关基因classⅢPI3 K、Beclin-1、P62 mRNA和蛋白LC3Ⅱ、P62、classⅢPI3K表达的影响。【结果】不同质量浓度的DON均可诱导PC12细胞自噬,各试验组细胞自噬水平均高于对照组(CK),并随着DON质量浓度的增大而先增加后下降,在DON质量浓度为1 000ng/mL时达到峰值。与对照组相比,各试验组classⅢPI3 K mRNA和Beclin-1mRNA表达水平均极显著增高(P0.01),P62mRNA表达水平随着DON质量浓度的增加总体呈下降趋势,差异达显著(P0.05)或极显著(P0.01)水平。Western-blot结果显示,LC3Ⅱ蛋白表达量在DON质量浓度为1 000ng/mL时最高,与对照组相比,250~2 000ng/mL DON处理组的LC3Ⅱ蛋白表达量显著(P0.05)或极显著(P0.01)增加;500~2 000ng/mL DON处理组classⅢPI3K蛋白表达量较对照组显著(P0.05)或极显著(P0.01)增加,其中以1 000ng/mL DON处理组表达量最高;与对照组相比,不同质量浓度DON处理组P62蛋白表达量均极显著降低(P0.01),其中以1 000ng/mL DON处理组最低。【结论】DON能够诱导PC12细胞发生自噬,自噬相关基因classⅢPI3 K、Beclin-1、P62及蛋白LC3Ⅱ、P62、classⅢPI3K等参与了DON诱导PC12细胞自噬的调控。     

黄曲霉毒素B1诱导MEK/ERK/ROS介导的巨噬细胞自噬反应

为研究黄曲霉毒素B1(AFB1)能否诱导细胞自噬,并初步探讨其可能的作用机制。利用免疫荧光、酶标仪检测、免疫印迹等技术检测经AFB1处理过的细胞的自噬水平、相关蛋白的表达量以及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生情况。结果表明:AFB1能够引起RAW264.7细胞和Hela细胞的自噬反应,并且该自噬为完全自噬。AFB1诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7自噬是依赖细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)途径发生的,并受ROS的调节。此外,发现AFB1诱导ROS产生呈浓度依赖性,而ROS抑制剂同时抑制了ROS和自噬发生,但自噬抑制剂并没有有效地抑制ROS的产生,表明ROS处于AFB1诱导自噬的上游,对自噬起到调节作用。这表明AFB1诱导的自噬现象在细胞中普遍存在,而自噬作为机体的免疫机制,在抵抗AFB1毒力侵染的过程中发挥重要作用。     

GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞自噬与凋亡的影响

【目的】细胞自噬和凋亡存在着相互制约,p38MAPK信号通路作为细胞凋亡的主要调控通路之一,也对细胞自噬存在促进和抑制的双重作用。已有研究表明,促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)对细胞自噬与凋亡均有影响,但作用机制尚不明确。故探究GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞(pGCs)自噬与凋亡的影响及其机理,为解决母猪的产子率以及同期发情等问题提供参考。【方法】从猪卵巢中提取卵巢颗粒细胞,进行体外培养。1、探究GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间:按孵育GnIH时间梯度(0min、10 min、30 min、60 min、90 min)分组,用Western blot检测猪卵巢颗粒细胞p38与p-p38的蛋白表达量变化;2、验证GnIH对p38MAPK信号通路的影响:按(空白对照、GnIH、p38激活剂(U-46619)、U-46619+GnIH)分组,用Western blot检测p38与p-p38的蛋白表达量变化;3、探究不同浓度GnIH对自噬和凋亡的影响:按(空白对照、10-6 mol·L-1 GnIH...     

富硒酵母干预对高脂小鼠GRP78基因表达的影响

目的:探讨富硒酵母干预对高脂大鼠内质网应激基因GRP78表达的影响.方法:选取40只6周龄小鼠作为研究对象,建立高脂小鼠模型,并随机分为4组(a:对照组,b:高脂日粮组,c:高脂日粮+低剂量富硒酵母组,d:高脂日粮+高剂量富硒酵母组),观察肝脏脂肪变性程度,检测肝脏脂质氧化MDA水平和GRP78基因的mRNA表达水平.结果:高脂日粮可以诱发小鼠肝脏指数增大和脂肪变性,饲喂富硒酵母后,小鼠的肥胖和肝脏脂肪变性得到了明显改善;高脂日粮组与其他组相比肝脏中MDA和GRP78基因的表达水平显著升高,高剂量硒酵母对高脂诱发的MDA升高和GRP78基因的表达水平均有拮抗作用.结论:硒能逆转高脂小鼠的肝脏损伤,内质网应激信号通路在其中发挥了作用,该应激可能是通过提高氧化水平而诱导的.     

梓醇调控自噬和凋亡促进 H2O2 诱导的 PC12 细胞存活

探讨梓醇对过氧化氢(H_2O_2)诱导的PC12细胞氧化损伤后调控凋亡和自噬相关分子的机制,采用0.01 mmol,0.1 mmol,1 mmol的梓醇预处理PC12细胞2h后,再用250μmol/L H_2O_2损伤细胞12h.MTT法检测细胞存活率,设置梓醇低、中、高3个剂量组(0.01 mmol,0.1 mmol,1 mmol),自噬抑制剂3MA阳性对照组,阴性对照组,H_2O_2诱导的PC12细胞损伤模型组,采用荧光单标检测LC3Ⅱ的表达,Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白Bcl2/Bax,LC3Ⅱ/Ⅰ和Cleaved-caspase 3的表达情况.结果显示,梓醇呈剂量依赖性地提高了H_2O_2诱导的PC12细胞的存活,并对H_2O_2诱导的PC12细胞的LC3Ⅱ/Ⅰ,Bcl2/Bax升高蛋白水平表达,降低了Cleaved-caspase 3的表达;随着梓醇浓度的增加,Cleaved-caspase 3的表达减少,而LC3Ⅱ/Ⅰ和Bcl2/Bax的表达在升高.得出梓醇通过恢复凋亡和自噬相关蛋白Bcl2/Bax,LC3Ⅱ/Ⅰ的平衡能够保护PC12细胞免于H_2O_2诱导的氧化损伤.     

绿茶多酚诱导肝癌细胞凋亡时Caspase-3蛋白活性与mRNA的变化

[目的]研究绿茶多酚(EGCG)诱导肝癌细胞Hep-G2凋亡过程中半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白活性与mRNA的变化。[方法]100 mg/L的EGCG处理Hep-G2细胞48 h,DAPI染色观察细胞形态学,用MTT检测EGCG对Hep-G2细胞生长的影响,流式细胞技术Annexin V-FITC PI法检测不同浓度EGCG诱导细胞的凋亡率,分光光度法检测Caspase-3的活性,用半定量RT-PCR法检测Caspase-3的mRNA变化。[结果]100 mg/L的EGCG作用Hep-G2细胞48 h后,荧光显微镜观察到细胞出现核碎裂和凋亡小体;MTT法检测到EGCG对肝癌细胞Hep-G2的生长均有显著抑制作用,呈浓度依赖性;Annexin V-FITC PI法检测到不同浓度的EGCG作用与肝癌细胞Hep-G2后,凋亡率较对照组明显升高,并随诱导浓度的增加而增加;不同浓度的EGCG处理组和不同时间EGCG处理组的Caspase-3活性和mRNA表达量均比对照组明显升高。[结论]Caspase-3蛋白活性与mRNA上调是EGCG诱导肝癌细胞凋亡的的重要原因和机制。     

电离辐射对鼻咽癌CNE-2细胞自噬活性的影响

目的 研究电离辐射对CNE-2细胞自噬活性和EPG5表达的影响.方法 CNE-2细胞用不同剂量电离辐射照射后,透射电镜、qRT-PCR、Western blot分别检测自噬形态、自噬标志物(P62、LC3)及EPG5表达;用RNA干扰技术(siRNA)沉默EPG5基因表达,qRT-PCR及Western blot检测自噬标志物及EPG5表达.结果 电离辐射引起自噬小体数量增加、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高(P＜0.01)、p62蛋白表达增加、EPG5 mRNA表达下调(P＜0.01).EPG5-siRNA转染后EPG5 mRNA表达下调(P＜0.01),P62、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P＜0.01).结论 电离辐射可能通过下调EPG5基因表达,阻滞自噬溶酶体形成,从而影响CNE-2细胞自噬水平.     

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对小鼠卵丘细胞自噬与胞吞相关因子表达的影响

卵丘细胞的质量对卵母细胞的生长发育至关重要,其自噬和胞吞可调控细胞生长及营养运输,以应对恶劣环境对卵母细胞质量的威胁。从促排处理的小鼠输卵管膨大部收集卵丘—卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes, COCs),分离卵丘细胞进行体外培养,并添加0、50、100、150和200 ng/mL IGF-1处理细胞,分别提取细胞总RNA和总蛋白,实时荧光定量PCR检测各处理组 Atg5、 Beclin1、 LC3、 Cav1和 Cav2 mRNA的相对表达水平。免疫荧光定位不同蛋白在细胞中的表达,并结合蛋白免疫印迹(Western-blot,WB)测定不同质量浓度IGF-1处理组Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2的蛋白表达水平,分析IGF-1对卵丘细胞自噬和胞吞的影响。结果显示:正常培养的卵丘细胞均可表达 Atg5、 Beclin1、 LC3、 Cav1、 Cav2 mRNA和蛋白,蛋白主要定位在细胞质。IGF-1可调控小鼠卵丘细胞Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2蛋白的表达,与对照组相比,各处理组的Atg5蛋白表达量均升高;Beclin1和LC3蛋白表达量显著降低,且在100 ng/mL IGF-1处理组中最低。Cav1和Cav2蛋白在50 ng/mL和200 ng/mL处理组的表达量均显著降低,但在该质量浓度变化范围内,随着IGF-1质量浓度增大,2种蛋白的表达量不是线性降低,而是在100 ng/mL和150 ng/mL处理组表达量有回升现象。表明IGF-1可调控小鼠卵丘细胞的自噬和胞吞相关因子的表达,调控效果与IGF-1的质量浓度有关。     

热应激对黄体孕酮代谢通路的影响

[目的]以假孕大鼠为模型,探讨热应激对氯前列烯醇(PGF)诱导的黄体退化过程中孕酮水平及其代谢通路相关蛋白表达的影响。[方法]用PMSG/h CG(D0)联合处理50只大鼠,诱导假孕,然后随机分为非热应激(NHS)和热应激(HS)两组。每天在相同时间,将HS组置于40℃应激2 h。假孕第7天,热应激结束2 h后,各组大鼠以PGF分别处理0、1、2、8和24 h后屠宰,收集血清和卵巢组织。用酶联免疫法检测血清孕酮浓度,蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法检测孕酮水平及其代谢通路相关蛋白的表达。[结果]热应激前、后假孕大鼠的直肠温度差异显著(P0.05);PGF降低了两组大鼠血清孕酮浓度,热应激抑制了PGF诱导的孕酮浓度下降(P0.05);PGF或热应激处理对PKA磷酸化底物、St AR、P450scc、3βHSD及NR4A1-F表达均无显著影响(P0.05),但均诱导NR4A1-S表达上调(P0.05),且热应激降低PGF诱导的NR4A1-S表达(P0.05);PKA磷酸化底物主要在类固醇生成细胞的细胞核中表达,而St AR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F均在类固醇生成细胞的细胞质表达。[结论]热应激降低了PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中NR4A1-S的表达,提示NR4A1-S可能参与调控黄体退化过程中孕酮的代谢。     

不同处理小鼠卵巢组织中HIF1α基因的表达分析及其真核表达载体构建

为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot技术检测转染细胞中HIF1α表达情况。结果表明:HIF1α在促排小鼠卵巢中的mRNA转录水平极显著高于普通小鼠卵巢组织(P0.01),在促排组和对照组的其他组织内HIF1αmRNA转录水平并无显著差异;HIF1下游基因VEGF和IGF-2在促排小鼠卵巢组织中的转录水平分别显著(P0.05)与极显著(P0.01)高于普通小鼠卵巢组织中的转录水平;卵泡发育至有腔卵泡后,HIF1α才开始在卵泡中表达;HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体能够在颗粒细胞中转录HIF1αmRNA并翻译成蛋白。结论:HIF1α只在有腔卵泡内表达,其转录水平与卵巢内有腔卵泡数量成正相关,HIF1α通过上调VEGF和IGF-2参与卵泡的发育及成熟。