羊种布鲁菌分离株bp26及omp10基因的分子进化与变异分析

为了解羊种布鲁菌内蒙古分离株和疫苗株的遗传变异情况,对羊种布鲁菌分离株B1、B2、B3、B4以及疫苗株M5、S2、A19的bp26及omp10基因进行了扩增、克隆和序列分析,并与国内外的代表性毒株进行了序列比对。结果显示:4株分离株的bp26序列长度均为900bp,开放阅读框为753bp,与疫苗株M5同源性为100%,疫苗株S2和A19的同源性为99.99%;分析发现所有序列中共有4处变异,A19 bp26基因的CDS区第304位A→G和第405位C→T突变,S2 bp26基因的第498位C→T和727位G→A突变;其中304位的A→G的变异导致其编码的氨基酸发生了从天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D),727位G→A的变异导致氨基酸发生了缬氨酸(V)到异亮氨酸(I)的变化;而分离株和疫苗株M5未发生变异。4株分离株的omp10序列长度均为513bp,开放阅读框为396bp,同源性为99.99%,与疫苗株S2和A19同源性为100%;分析发现疫苗株M5的omp10基因序列发生了1处变异,第144位C→T,但没有引起氨基酸改变,其他菌株没有发生变异。     

布鲁菌疫苗株S2全基因组测序及功能分析

为找出布鲁菌疫苗株S2基因组分泌性蛋白、参与生物学途径基因、细胞组件基因、分子功能基因、毒力相关因子及耐药基因,对布鲁菌疫苗株S2全基因组测序并进行Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测、GO注释、VFDB注释、ARDB注释。全基因组测序结果表明,S2基因组大小约为3.3 Mb,杂合度和重复度较低,GC含量分布未出现异常。通过Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测未找出S2分泌性蛋白。通过GO数据库注释,发现参与生物学途径基因有3 823个、细胞组件基因有1 949个、分子功能基因有2 585个。通过VFDB数据库注释,找出S2基因组有79个毒力相关基因,其中最大基因为8 604bp,最小基因为180bp。通过ARDB数据库注释,找出S2基因组有13个耐药基因,最大基因为3 225bp,最小基因为333bp;其中功能注释的有GL002835基因,是枯草杆菌肽类基因,此基因耐受抗微生物类药物。本研究为进一步了解布鲁菌S2基因组基本功能奠定了基础。     

布鲁菌种属鉴定多重PCR方法的建立及初步应用

用BCSP31作为布鲁菌属特异性基因,以IS711基因拷贝数差异作为布鲁菌种间特异性标志,建立了布鲁菌种属特异性的多重PCR鉴定方法.用建立的多重PCR方法对11株(牛种A19,A544,A387;羊种M111,M28,M16;犬种RM6/66;绵羊种63/290;猪种S2,rS2,S1330)不同种来源的布鲁菌菌体和基因组进行鉴定,结果牛种菌能扩增大小分别为494,223,178 bp 3条带,羊种菌能扩增出大小分别为733,223,178 bp 3条带,犬种菌能扩增出大小分别为223,178 bp 2条带,绵羊种菌能扩增出大小分别为976,223,178 bp 3条带,猪种菌能扩增出大小分别为285,223,178 bp 3条带.均与预期一致;而作为对照的大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、流产沙门菌和都柏林沙门菌,均未扩增出任何务带.结果表明,本研究所建立的方法具有良好的特异性,能够区分不同种源的布鲁菌,可用于布鲁菌种属的快速鉴定和流行病学调查.     

中国牛种布鲁菌弱毒疫苗株A19 SNP位点的研究

为鉴别我国牛种布鲁菌弱毒疫苗株A19与野生菌株,运用生物信息学方法结合基因测序,对疫苗株A19基因组SNP位点分析筛选,选取其中部分SNP位点,通过与布鲁菌常见种、生物型标准参考菌株和弱毒疫苗株基因组SNP位置核苷酸测序比较,验证SNP位点的A19特异性。结果表明,共筛选获得A19基因组29个SNP位点,验证ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503这3个SNP位点为A19（或S19）特异,揭示了A19基因组SNP位点分布情况,为疫苗株 A19与野生菌株鉴别提供了分子依据。     

牛布鲁菌强毒株544与猪型疫苗株S2基因组差异筛选与鉴定

应用代表性差异分析技术(Representational difference analysis,RDA)对流产布鲁菌强毒株544和疫苗株S2进行基因组差异分析。经过3轮差减杂交,对差异片段进行Southern-blot验证,BLAST分析和PCR鉴定,最终获得疫苗株S2特有的3条差异片段与已测序的所有猪布鲁菌(Brucella suis)同源性均为100%,只在弱毒株S2基因组中检测出,而在强毒株544中不存在,为建立布鲁菌自然感染菌与疫苗株的基因鉴别诊断方法奠定了基础。     

羊用布鲁菌病疫苗研究进展

布鲁菌病是重要的人兽共患病,对畜牧业发展和人类健康威胁严重。疫苗免疫仍是目前预防和控制动物布鲁菌病的措施之一,用于羊布鲁菌病防控有多种疫苗,如S19、RB51、Rev.1等,每种疫苗均各有利弊。现今,众多研究者也通过基因工程等技术积极研究DNA疫苗、基因缺失疫苗、亚单位疫苗等。论文就羊用布鲁菌病疫苗的应用及新型疫苗的研究现状进行综述,以期为羊布鲁菌病的预防提供参考。     

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。     

牛布鲁菌病奶液PCR检测方法的建立及初步应用

为探讨以牛奶为材料检测牛布鲁菌感染的可行性,本试验建立了可鉴定布鲁菌属的单重PCR以及可鉴定布鲁菌种的多重PCR.结果显示,单重PCR方法的特异性强,只特异性的扩增布鲁菌DNA,对照菌株大肠杆菌、牛败血性波氏杆菌、根瘤农杆菌和苍白杆菌的扩增结果均为阴性;奶液中细菌检测灵敏度为1.08×104CFU/mL.用建立的多重PCR对7株不同种的布鲁菌体和基因组进行鉴定,表明该方法可以区分不同种布鲁菌.本试验中建立的PCR方法能够鉴定所有致病性布鲁菌并对疫苗株和野生毒株加以区分,适用于实验室布鲁菌的快速鉴定.     

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。     

鉴别布鲁菌A19疫苗株的双重荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种可以鉴别布鲁菌A19疫苗株和其他布鲁菌的双重荧光定量PCR方法,分别设计特异性扩增布鲁菌BCSP31基因序列和A19疫苗株缺失序列的2套引物探针,对引物和探针浓度进行优化,并对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果表明,用该方法对2种阳性质粒标准品的最低检测限均为10拷贝/μL;该方法扩增A19疫苗株的核酸时只呈现出1条特异性的扩增曲线,扩增其他布鲁菌菌株(包括疫苗株与野毒株)的核酸时,会出现2条特异性的扩增曲线,而非布鲁菌的细菌核酸均未出现特异性的扩增曲线。该方法的批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对122份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法和Bruce-Ladder PCR方法,并可对A19疫苗株的核酸进行鉴别。本研究建立的鉴别布鲁菌A19疫苗株的双重荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可作为临床上进行A19疫苗株鉴别的一种检测方法。     

3株非典型羊源布鲁菌的基因分型研究

[目的]探讨采用基因分型方法对非典型布鲁菌鉴定的实用性,为非典型菌株的鉴别提供参考。[方法]采用常规鉴定方法和VITEK 2.0全自动细菌鉴定分析系统对菌株进行初步鉴定,利用AMOS-PCR进行种型鉴定,应用多位点可变数目串联重复序列分析方法(MLVA)确定菌株的基因型。[结果]常规鉴定结果显示试验菌株为疑似布鲁菌;VITEK 2.0全自动细菌鉴定系统显示3株试验菌株均为布鲁菌;AMOS-PCR扩增表明试验菌株均为羊种菌,MLVA聚类分析表明试验菌株与羊种2型布鲁菌紧密地聚为一类,属东地中海基因型,并在Panel 2B中发现了新的基因型(4-4-3-7-5),命名为CN2B-45。[结论]MLVA基因分型方法对非典型布鲁菌具有极高的分辨力,是非典型布鲁菌分型鉴别的最佳策略。     

重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法及免疫原性研究

[目的]探索重组布鲁菌Omp19蛋白的制备方法,评价其在实验动物中的免疫原性,为中试工艺放大奠定基础。[方法]利用摇瓶培养对重组Omp19蛋白进行原核诱导表达,对培养基类型、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间、诱导时的菌体密度等条件进行筛选;利用阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析对重组Omp19蛋白进行纯化制备;利用SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）对重组Omp19蛋白的纯度进行鉴定;利用动物实验评价制备的重组Omp19蛋白的免疫原性。[结果]摇瓶培养试验表明,重组布鲁菌Omp19蛋白较优的表达条件为：使用LB培养基,在菌密度OD_{600 nm}值为0.6~1.0时加入0.5 mmol/L的IPTG,于28 ℃诱导5 h;经3步纯化后,获得了高纯度的重组Omp19蛋白;免疫原性研究表明,经方法优化后制备的重组Omp19蛋白联合佐剂可以较好地刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体。[结论]优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法,评价了其在小鼠中的免疫原性,为重组布鲁菌疫苗的研发提供了实验基础。     

Control of small ruminant brucellosis by use of Brucella melitensis Rev.1 vaccine: laboratory aspects and field observations

Brucellosis vaccines are essential elements in control programs. Since first developed in the mid-1950s, the Brucella melitensis vaccine strain Rev.1 has been used worldwide and its significant value in protecting sheep and goats in endemic areas recognized. This review provides historical background on the development of the vaccine, its use and field complications arising in Israel following changes in the strain’s pathogenicity. The urgent need for resolving cases of vaccine strain excretion in the milk, horizontal transfer and a unique case of human infection has led to identification of an atypical B. melitensis biovar 1 strain that resembles strain Rev.1 in susceptibility to penicillin and dyes. An omp2 based PCR method has been developed that traced the lineage of Israeli B. melitensis biovar 1 strains. This locus serves as an epidemiological tag for the Rev.1 vaccine strain. Despite the rapid development of new approaches in the field of vaccination, it is anticipated that in the near future the Rev.1 vaccine would remain the only accepted vaccine in national control programs.     

猪传染性胃肠炎病毒疫苗株S基因的克隆及其与流行株的比对分析

[目的] 分析猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）疫苗株和流行株S基因的遗传变异特征。[方法] 利用RT-PCR方法对国内目前广泛使用的TGEV疫苗株A、B、C的S基因进行克隆并测序,将获得的序列与近年来公开发表的分离自不同地区的TGEV 毒株S基因序列进行比对分析;选取NCBI中登录号为AF104420.1-Britain、AY587882.1-Nanjing、DQ811786.2-America、EU074218.2-Harbin、FJ755618.2-Harbin、JQ700304-fuzhou、KC609371.1-Shanghai、KX900411.1-United States、M94099.1-Spain和MK272773.1-Fushun 的TGEV 流行株S基因序列,与疫苗株A、B、C的S基因序列一起,利用MegAlign软件进行比对分析。[结果] 疫苗株A、B、C的S基因序列两两间的同源性均在96.7%以上;疫苗株A、B、C的S基因序列与NCBI中流行株S基因序列的同源性分别在94.43%~99.82%、95.30%~99.64%、93.48%~98.38%;由遗传进化树可知,疫苗株A、C与国外流行株M94099.1-Spain在同一分支上,疫苗株B与国内流行株JQ700304-fuzhou在另一分支上。[结论] TGEV疫苗株的S基因与流行株同源性较高,变异性不大。     

The genome of Brucella melitensis

The genome of Brucella melitensis strain 16M was sequenced and contained 3,294,931 bp distributed over two circular chromosomes. Chromosome I was composed of 2,117,144 bp and chromosome II has 1,177,787 bp. A total of 3198 ORFs were predicted. The origins of replication of the chromosomes are similar to each other and to those of other -proteobacteria. Housekeeping genes such as those that encode for DNA replication, protein synthesis, core metabolism, and cell-wall biosynthesis were found on both chromosomes. Genes encoding adhesins, invasins, and hemolysins were also identified.     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

羊口疮病毒内蒙古株的分离与初步鉴定

[目的] 确定内蒙古地区规模化养殖场发生的疑似羊口疮的病原。[方法] 无菌采集疑似羊口疮病料7份,经剪碎、研磨、离心等处理后接种山羊皮肤成纤维细胞（goat skin fibroblasts,GSFs）培养;对分离到的病毒毒株进行电镜观察;利用B2L基因引物进行特异性PCR鉴定,对获得的B2L基因序列测序,构建系统发育树,并进行同源性分析。[结果] 3份病料经GSFs培养48 h后出现明显病变,分离的病毒经负染后在电镜下观察呈卵圆形,病毒粒子长220~250 nm,宽125~200 nm,符合羊口疮病毒（orf virus,ORFV）粒子的形态特征,并将其命名为NM-ORFV-1株、NM-ORFV-2株、NM-ORFV-3株。分离株经B2L基因PCR鉴定获得1 137 bp的扩增产物,与预期一致;系统发育树及同源性分析显示,NM-ORFV-2株与NM-ORFV-3株遗传关系密切,处于同一分支,且与ORFV KP336704（中国）分离株的亲缘关系最近,同源性达到99.4%;NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株及NM-ORFV-3株处于不同分支,NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株的同源性为99.1%,与NM-ORFV-3株的同源性为99.0%,且与ORFV JQ904789（中国）疫苗株亲缘关系最近,同源性为99.6%。[结论] 内蒙古地区规模化养殖场疑似羊口疮病例的病原是ORFV。     

多重耐药胸膜肺炎放线杆菌GD2107株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】通过对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)GD2107株进行全基因组测序及生物信息学分析,丰富APP基因组数据库信息;构建基于ApxⅣ基因的系统进化树,分析该菌株的进化关系,为探索APP致病机制和临床防控猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia,PCP)提供参考。【方法】通过药敏试验测定分离菌株的耐药谱;采用全基因组测序技术(whole genome sequencing,WGS)对细菌DNA进行全基因组测序,分别利用Illumina NovaSeq、PacBio SequeI测序平台对全基因组测序结果进行基因功能注释及生物信息学分析(包括基因组基本信息、功能元件分析及亚系统分析等);基于ApxⅣ基因构建系统进化树。【结果】药敏试验结果显示,GD2107菌株对青霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)、卡那霉素等14种抗菌药均耐药。对GD2107株全基因组测序得到1条大小为2 271 987 bp的环状染色体(GC含量为41.21%)和2个大小分别为5 027和3 497 bp的环状质粒,共预测到2 290个编码基因,包含19个rRNA (7个5S rRNA、6个16S rRNA、6个23S rRNA)、21个tRNA基因、20个ncRNA;23个基因岛、4个原噬菌体和2组CRISPR相关序列;分别有2 112、1 549和1 866个基因在COG、KEGG和GO数据库中得到注释,且相关蛋白集中分布于APP的代谢过程;另外在毒力因子(VFDB)和耐药因子(CARD)数据库中还注释到48个毒力基因和22个耐药基因(仅floR基因位于质粒上)。绘制该菌株的全基因组圈图,将基因组信息提交至NCBI,获得染色体GenBank登录号为CP097377,质粒登录号分别为CP097378和CP097379。系统进化树分析发现,该菌株与来自中国的APP菌株(CP063424.1)进化关系最近。【结论】本研究完成了对多重耐药菌株GD2107的全基因组测序与生物信息学分析,全面认识了该菌株基因组的结构和功能并探究了耐药和致病机制中的相关基因,进化关系显示该菌株具有一定的地域流行性,为预防PCP的流行和探索APP的致病机制提供了参考。     

Protection against Brucellosis in Goats,Five Years after Vaccination with Reduced-Dose Brucella melitensis Rev 1 Vaccine

The protection conferred by the reduced-dose Rev 1 Brucella melitensis vaccine in goats that had been immunized 5 years previously was evaluated. Sixteen goats vaccinated 5 years before with Rev 1 (1 x 10(5) cfu) and 5 non-vaccinated goats were challenged with B. melitensis 16M (4 x 10(5) cfu) using the conjunctival route. After giving birth or aborting, the goats were sacrificed and tissue samples were taken for bacteriological study. The challenge strain was recovered in 12%, of the animals from the vaccinated group, and in (80% of the control group. It is concluded, therefore that the use of reduced-dose Rev 1 protects goats vaccinated in endemic areas for at least 5 years after immunization.