猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。     

实时荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒方法的建立及应用

本研究将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因部分片段克隆并连接到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒,以此为标准模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对20份临床疑似病料进行检测,发现14份为荧光定量RT-PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出10份。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

非典型性瘟病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快捷、特异、敏感检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ZKHFQ株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物,经过对反应条件进行优化,建立了检测PEDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。该方法对常见的病毒均未检测到荧光信号,而仅对PEDV检测为阳性,其灵敏度为57拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对26份疑似PEDV感染的病料样品进行检测,结果显示本研究所建立的方法对PED的检出率比常规PCR高23.07%。本实验建立的荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可以用于临床PEDV的检测。     

鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据Gen Bank公布的犬瘟热毒株的全基因序列并参考相关文献,选择M基因保守区域合成了1对通用引物M1/M4及鉴别犬瘟热强弱毒株的特异引物M2和M3。试验证明,该方法重复性良好;检测强弱毒株的最低检出限度在10拷贝;对新城疫病毒、水貂肠炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬细小病毒5种病毒的特异性检测均为阴性;对175份犬瘟热疑似病料进行荧光定量RT-PCR,检出127份阳性样品,其中强毒株98份,弱毒疫苗株29份,常规RT-PCR检出112份阳性样品。结果表明,该方法的敏感性高于常规RT-PCR检测,并能有效的鉴别强弱毒株。     

猪星状病毒4型SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL-1,其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R2=1.00。应用该方法检测了2018-2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。     

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。     

基于Taq Man探针的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL;用该方法对6份不同的组织样品进行重复性检测.结果显示具有良好的重复性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法与常规RT-PCR阳性符合率为100%.但检测灵敏度高出常规RT-PCR 100倍.     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、量化、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,设计1对PEDV N基因的特异性引物,建立Eva Green染料的实时荧光定量RT-PCR的检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测。结果显示,所建立的实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999;不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生交叉反应,具有较强的特异性;灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍;重复性试验的变异系数均小于5%,重复性良好。对43份临床样品进行检测,结果比普通PCR多检出2份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法在特异性、灵敏度和重复性方面都很好,可用于临床PEDV检测。     

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV）的非结构蛋白2（Nsp2）基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR（Real-time fluorescent quantitative RT-PCR）检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LP-PRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达10¹拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法.结果显示,该方法在检测101 copies/μL～108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系.标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100％和107％;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5％,具有良好的重复性.利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM) 72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录 水平显著上调.本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法.     

猪细小病毒4型Taq Man荧光定量PCR方法的建立与应用

根据GenBank中发表的猪细小病毒4型(PPV4)全基因组序列,针对其结构蛋白VP2基因的保守序列,设计合成特异性引物及TaqMan探针,以VP2克隆质粒为标准品,通过对探针浓度、引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度以及退火温度进行调整,建立了PPV4的TaqMan荧光定量PCR.反应条件优化后,该方法在6.73×10...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异野毒株与JXA1-R疫苗毒株快速鉴别方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）变异野毒JXA1的基因变异序列和疫苗株JXA1-R的基因遗传标志设计合成了2对特异性引物,结合快速RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立了JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒的快速鉴别体系,其目的片段大小分别为400、290 bp,该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒的PCR检测结果均为阴性;对JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒RNA的最低检测量分别为103、104拷贝/μL。该方法敏感、特异,适用于临床样品的检测。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用简

据猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）S基因序列设计1对特异性引物,通过对实时荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法,同时对12份病料进行检测,并与常规RT-PCR进行比较。结果显示,该方法的敏感性达到43.07拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性,而常规RT-PCR最低只检测到4.307×10³ 拷贝/μL,敏感性较低。本试验建立的检测TGEV S基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法为传染性胃肠炎的鉴别诊断及TGEV的分离鉴定奠定了技术基础。     

鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32×lg Copy number+41.151,R2=0.998,R循环效率Eff%=100.072,DNA拷贝数在101～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,变异系数低于5%。利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%,而用本实验室建立的普通RT-PCR方法检测的阳性检测率为85%(17/20)和75%(15/20)。建立的方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R²=0.999;敏感性高,最低检测限为1×10¹拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。