H9N2禽流感病毒核蛋白NP单克隆抗体的制备

为了了解抗H9N2禽流感病毒(AIV)单克隆抗体的确切用途,试验用纯化后的H9N2禽流感病毒免疫Balb/c小鼠,经细胞融合后再进行筛选。结果表明:获得2株能够稳定分泌抗H9N2 AIV的杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和3D6,2株单克隆抗体的腹水效价分别为1∶25 600和1∶12 800;应用间接ELISA和间接免疫荧光检测显示,2株单克隆抗体均能与H9N2亚型AIV发生反应;进一步研究发现,3D6可以与H9N2 AIV中的NP蛋白结合,使得表达NP蛋白的MDCK细胞显现出绿色荧光。说明3D6是一株针对H9N2 AIV NP蛋白的单克隆抗体。     

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚.选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点...     

采用反向遗传学技术构建clade7..2 H5N2亚型禽流感病毒高产疫苗株

为构建H5N2亚型禽流感病毒(AIV)高产疫苗株,研究采用反向遗传操作技术删除Clade 7.2 H5N2亚型AIV A/chicken/Shanxi/Q6/2013(wt-Q6株)血凝素(HA)基因多碱性氨基酸序列,以wt-Q6株HA和神经氨酸酶基因为供体,结合A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的6个内部片段骨架,构建针对此种变异的H5亚型AIV疫苗株,成功拯救出一株重组病毒r Q6/PR8。该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖滴度,对SPF鸡胚和鸡无致病性,具有低毒高产的特性,符合疫苗候选株的标准。     

H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV (简称H7N9AIV) mRNA疫苗，本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021 (H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人β-球蛋白和非洲爪蟾β-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR)，构建了中间转录质粒p GEM-YN和p XT7-YN，以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA m H7-YN-p GEM和m H7-YN-p XT7；将2种mRNA转染HEK293T细胞，western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带；通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达，结果显示，3μg mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强；将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明，本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的m...     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

重组禽流感病毒(H5N2)的拯救及其生物学特性分析

为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感(Avian influenza virus,AIV)和筛选具有标记的疫苗毒株,用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV(A/PR/8/34毒株)的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2/PR8株。为了降低重组病毒的毒力,对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰,使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。将获得的rH5N2/PR8株在9日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048,其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1 mL。该病毒的毒力显著降低,对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5/0.1 mL。将该病毒灭活与油佐剂乳化,制成灭活疫苗,给6周龄SFP鸡接种不同剂量,接种21 d后,用H5N1流行野毒A/Chicken/SD/2010(H5N1)攻击,结果显示:接种剂量为0.1 mL/只的试验组,10只鸡中有5只获得保护;接种0.3 mL/只的试验组可获得100%保护。以上说明,本实验获得的重组病毒具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点,非常适合作为"标记疫苗"候选株,为AIV(H5N1)的标记疫苗研发奠定了坚实基础。     

H9N2亚型禽流感病毒糖基化位点突变株的构建与生物学特性研究

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。     

H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。     

Clade2.3.2 H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建

近年来Clade2.3.2H5N1亚型的禽流感病毒逐渐成为我国及越南等其他一些国家流行的优势毒株,并呈现出一定变化规律的氨基酸进化趋势。本研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV为内部基因供体,以Clade2.3.2H5N1亚型AIV A/chicken/Yangzhou/1117/2011(YZC3)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体,通过反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的COS-1细胞中救获低致病性的疫苗毒株。结果成功拯救出1株重组病毒rYZC3,该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,对SPF鸡和鸡胚无致病性。本研究为防控当代流行的H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。     

重配H9N1亚型流感病毒感染性克隆的构建及鉴定

为了研究禽流感病毒的反向遗传,试验采用霍夫曼发明的8质粒拯救系统,将分离得到的AIV Isolate3(H9N2)基因组,通过RT-PCR得到HA基因,并克隆到以pcDNA3质粒为骨架自行构建的双向转录/表达载体pHW2008上,得到HA转录/表达质粒,再将HA表达质粒与构建好的包含A/Puerto Rico/8/34(H1N1)7个内部基因双向转录/表达质粒共转染人肾上皮细胞(293T)与犬肾细胞(MDCK)混养细胞。结果表明:试验成功构建了重配H9N1亚型流感病毒减毒株。     

利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感病毒中和活性单克隆抗体

为筛选H5N1禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)特异性中和抗体,本研究构建了表达HA蛋白的重组质粒,利用该重组质粒及缺失表达人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)囊膜蛋白基因的骨架质粒,构建了表面整合有H5亚型AIV HA蛋白的HIV假病毒。利用该假病毒系统,筛选得到一株具有中和活性的单克隆抗体(MAb)。经测定,该MAb与纯化的全病毒具有较好的反应性,其对HIV-H5HA假病毒的中和效价为64。中和试验表明该MAb能够有效阻断野生型病毒对鸡胚的感染。本研究结果为开发H5N1 AIV的被动免疫治疗方法奠定了基础,同时对亚单位疫苗的研制也具有一定的意义。     

两株家鸭禽流感病毒H3N1亚型分离株的致病性及其表面糖蛋白基因序列分析

测定了2株禽流感病毒（AIV）Dk／YZ／231／02和Dk／YZ／3／04对SPF鸡和BALB／c小鼠的致病性；对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行了测定，并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果，此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性，而对BALB／c小鼠无致病性；Dk／YZ／231／02株的HA基因与Dk／Ukraine／1／63（H3N8）株的同源率最高，Dk／YZ／3／04株的HA基因与Petbird／HK／1559／99（H3N8）株的同源率最高；而Dk／YZ／231／02株的NA基因与Dk／Fuiian／17／2001（H5N1）株的同源率最高，Dk／YZ／3／04株的NA基因与Gs／Guangdong／1／96（H5N1）株的同源率最高。进化分析结果表明，Dk／YZ／231／02和Dk／YZ／3／04株的NA基因均可能起源于水禽源H5N1亚型AIV，这可能是不同亚型AIV在水禽体内基因重组的结果。推导的氨基酸剪切位点序列均为PEKQTR，属于非高致病性AIV的特征序列。     

H9N2亚型禽流感病毒细胞高产株的拯救

为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗株,本研究在对病毒生长特性及HA基因遗传进化分析的基础上,筛选出一株细胞高度适应的国内流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2) (SH11),并通过反向遗传操作技术拯救出全部基因均来自亲本株的AIV rSH11株.生物学试验结果表明rSH11在鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)、遗传稳定性等方面均与亲本株保持一致,rSH11经MDCK细胞连续传5代后血凝价稳定在1∶1024,表明该病毒株具有细胞高度增殖的特性.采用rSH11株制备油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡,免疫一周即可以检测出HI抗体,免疫3周后HI抗体平均效价高于1∶700,表明其具有良好的免疫原性.rSH11疫苗对不同的H9N2病毒株能够产生良好的免疫保护作用,显著抑制免疫鸡排毒.H9N2亚型AIV细胞高产株的拯救为该亚型AIV细胞苗的研制奠定了基础.     

一株鸭源H11N3亚型禽流感病毒的遗传进化分析及对小鼠的致病性研究

为了解H11N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性，本研究对2020年在福州市某活禽市场鸭中分离的一株H11N3亚型AIV进行了全基因组测序、遗传进化分析和对BALB/c小鼠的致病性试验。测序结果显示，分离株HA裂解位点为PAIASR↓GLF，符合低致病性AIV分子特征；HA蛋白²²⁶L和²²⁸S突变显示病毒具有结合人源受体(SAα-2,6 Gal)的特征性氨基酸。PB1、PA、NP和M1蛋白均出现对哺乳动物致病性增强的特征性氨基酸。遗传进化分析显示，H11N3 AIV的8个基因节段均属于欧亚分支，其HA基因与A/duck/Fujian/SD061/2017 (H11N3)株HA基因序列相似性最高，而NA基因与A/EN/Fujian/02754/2016 (H3N3)株NA基因序列相似性最高。该病毒内部基因分别与浙江、福建和云南等地鸭和鸡体内分离的H7N9、H7N7、H1N2、H7N2、H7N7和H9N6等亚型AIV相关基因高度同源。小鼠致病性试验结果显示，该病毒未经适应即可在小鼠鼻甲和肺脏中高效复制，表明该病毒株具备感染哺乳动物的能力。上...     

Clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感疫苗候选株的构建

2015年秋季以来,clade2.3.4.4的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)分离率逐渐增加,成为我国华东地区流行的优势毒株。经遗传进化分析发现,与抗原性相关的血凝素(HA)氨基酸呈现出一定规律的进化趋势,导致抗原性发生变化。研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)AIV为内部基因供体,以clade2.3.4.4中的H5N2亚型毒株A/chicken/Yangzhou/YZ1111/2015(YZ1111)的表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)为外部基因供体,并删除YZ1111株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,通过反向遗传操作,成功拯救出1株重组病毒r YZ1111。r YZ1111在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。表明在分析H5N2亚型AIV抗原变异的基础上研发出疫苗候选株,为防控变异的clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感提供了备选疫苗。     

H7N9禽流感荧光报告病毒的构建及初步应用

为实现对H7N9禽流感病毒(AIV)感染过程的动态可视化示踪,本研究构建了重组报告质粒pHH21-NS-Venus、pHH21-NS-Apple和包含H7N9 AIV CK/SD008株的8个基因节段的重组质粒pHH21-PB2-627E、pHH21-PB2-627K(来自CK/SD008-627K株)、pHH21-P...     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及生物学特性分析

1994年以来,H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在中国广泛流行,给养禽业造成了巨大损失。病毒已表现出明显的遗传和抗原多样性,但是对于其抗原性的演化研究较少。本研究选取2014年H9N2亚型AIV分离株A/chicken/Jiangsu/TM118/2014制备针对其血凝素的单克隆抗体,共获得8株稳定分泌针对血凝素蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为4B6、3F2、6D11、6B5、1H6、1G6、2D11、3D2,腹水HI效价在2~(11)~2~(19)之间;特异性鉴定结果显示,8株单克隆抗体仅特异针对H9亚型禽流感病毒,而与其他亚型禽流感病毒及其他感染家禽的常见病毒不反应;广谱性分析显示,6D11可以与所选毒株的绝大部分反应,其它7株与不同年代、不同谱系的反应性不同;8株单克隆抗体均能与感染H9亚型禽流感病毒的MDCK细胞特异性反应,呈现绿色荧光。本研究所获得的单克隆抗体可在H9亚型禽流感病毒的抗原性位点分析、流行病学监测及临床检测中发挥重要作用。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定

参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。     

A／African Startling／England—Q／983／79（H7N1）与我国HTN2亚型禽流感病毒分离株的比较

本研究通过反转录-聚合酶链式反应（ILT-PCR）技术分别扩增了禽流感病毒A/African Starfling／England-Q／983／79（A．S／E．Q）（H7N1）的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA基因，将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定；并将克隆到的8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较分析。结果表明所克窿到的8个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架；HA、NA基因的序列分析表明A．S／E．Q符合低致病力禽流感病毒的特征；与我国H7N2亚型AIV分离株A／chicken／Hebei／1／02的序列比较发现。A／chicken／Hebei／1／02的HA、M、NP、PB1、队基因与A．S／E．Q同源性最高，说明我国北部分离的AIV起源于A．S／E．Q。     

核酸免疫制备抗猪流感病毒HA单克隆抗体

为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。