大熊猫源轮状病毒CH-1株VP3基因的克隆与生物信息学分析

为了研究大熊猫轮状病毒VP3基因,为以后研究此基因的生物学功能、建立该病毒的检测方法以及研制新型大熊猫轮状病毒基因疫苗奠定基础,试验采用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP3基因,将其与p MD19-T Simple载体连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果表明:成功获得大熊猫轮状病毒VP3蛋白基因,长为2 591 bp,包含1个2 508 bp的开放阅读框,编码835个氨基酸,测序结果在Gen Bank中的登录号为HQ641295。VP3蛋白基因编码产物分子质量为97 937.91 u,最大疏水指数为2.256,最小疏水指数为-3.000;无信号肽序列;无跨膜结构;在线预测VP3有37个抗原表位;预测其可能包含10个N-糖基化位点,1个c AMP-c GMP独立蛋白激酶磷酸化位点,20个蛋白激酶C磷酸化作用位点,18个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点,1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点,5个N-豆蔻酰化位点。大熊猫轮状病毒的VP3基因与猪轮状病毒VP3基因的进化距离最近。     

猪轮状病毒贵州株VP7基因克隆及生物信息学分析

为了解贵州省猪轮状病毒(PoRV)VP7蛋白的结构及功能,根据Gen Bank发表的猪轮状病毒VP7基因序列设计1对特异性引物,扩增1株猪轮状病毒贵州流行株VP7基因全序列并进行序列测定及生物信息学分析。结果显示:VP7基因全长为1 062 bp,包含一个981 bp的开放发阅读框,编码326个氨基酸,氨基酸突变主要发生在高变区。与已知的14个国内外参考毒株VP7核苷酸和推导的氨基酸序列比较,同源性分别为71.5%~97.0%和72.4%~98.7%,与G4型毒株核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为86.6%~97.0%和92.9%~98.7%。核苷酸系统进化树结果显示,贵州流行株与G4型毒株CMP070/09属同一个分支,因此推测贵州流行株为G4型猪轮状病毒。预测PoRV VP7蛋白理论相对分子质量为37.2 ku,等电点为4.75,半衰期为30 h,不稳定系数为31.22;跨膜结构及信号肽分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,无信号肽区域;抗原表位预测显示VP7蛋白在第69~104、145~150、176~183、210~224、311~321位及其附近肽段可能为其优势抗原表位;结构预测显示,VP7蛋白存在1个N-糖基化作用位点、14个磷酸化位点,不存在O-糖基化位点。     

猪环曲病毒N基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪环曲病毒(PToV)N蛋白的生物信息学特征,运用RT-PCR技术扩增猪环曲病毒N基因,测序并对其进行生物信息学分析。结果成功获得了492bp的PToV N基因(GenBank登录号为KM036209)。经生物信息学分析,此序列编码163个氨基酸,理论等电点(pI)为12.14,理论分子质量为18 695.5u,不稳定系数为77.47;不同密码子对同一氨基酸选择上呈现一定的偏嗜性;最大疏水指数为1.589,最小疏水指数为-3.533;无信号肽和跨膜区;抗原表位主要位于N末端和C末端。预测其可能包含4个N-糖基化作用位点,2个蛋白激酶C磷酸化作用位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、1个N-豆蔻酰化位点。进化树分析结果显示,KM036209与韩国株和上海株亲缘关系很接近,与荷兰及西班牙株不属于同一分支。     

猫细小病毒VP2基因克隆与生物信息学分析

为了解猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）VP2蛋白的分子特点及变异规律,克隆FPV山东分离株SD-01的VP2基因,对其进行生物信息学分析。首先,以FPV阳性病料基因组DNA为模板,PCR扩增VP2基因并克隆获得重组质粒pMD18-T-FPV SD-01-VP2。测序结果显示：VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;氨基酸同源性比对发现,与其他FPV分离株的VP2基因氨基酸同源性较高,可达99.0%~100%。生物信息学分析结果显示：VP2蛋白为非分泌型的亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域;二级结构中α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲分别占8.7%、24.5%、4.3%和62.5%;三级结构预测发现,VP2蛋白以无规则卷曲为主,与二级结构预测结果一致。亚细胞定位预测显示,VP2蛋白不含有线粒体导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP）,定位在细胞质和细胞核中的概率较高,分别为47.8%和26.1%。B细胞抗原表位预测结果显示,VP2蛋白的抗原性及表面可及性较高,共含有11个潜在的优势B细胞抗原表位。蛋白翻译后修饰预测结果显示,VP2蛋白可能含有49个潜在磷酸化修饰位点,6个N-糖基化修饰位点和21个O-糖基化修饰位点,且这些修饰位点在FPV VP2蛋白内高度保守。本研究有助于了解我国FPV流行情况,掌握其重要结构蛋白VP2的理化性质和特性,从而为下一步VP2蛋白功能研究和疫苗研发奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌OMP2基因的克隆及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的副猪嗜血杆菌（HPS）全基因组序列中的外膜蛋白OMP2基因的核苷酸序列,利用Premier Primer5.0和Oligo6.0软件设计1对特异性引物,对从贵州省分离的HPS的OMP2基因进行扩增、克隆、测序和生物信息学分析。测序结果比表明,扩增的HPS分离菌株目的基因长度为1092bp,共编码363个氨基酸,与GenBank上公布的SH0165株（NC₀11852）中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性100%。生物信息学分析结果表明,OMP2外膜蛋白的分子质量为39087.45Daltons,理论等电点pI为9.21,不稳定系数为16.73,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为70.63,总体平均亲水性为-0.494,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈散在分布,有8个主要的抗原表位;OMP2外膜蛋白序列最前端的19个N-末端氨基酸残基为信号肽序列,最佳切割位点在19～20个氨基酸,且信号肽区域主要为疏水性氨基酸;该蛋白无跨膜区;预测OMP2外膜蛋白可能含有4个N-糖基化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、7个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、9个N-肉豆蔻酰化位点。     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF25基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25蛋白的结构特征和进化关系,采用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF25基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF25基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的三株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长1824 bp的ORF25基因,编码608个氨基酸;预测ORF25基因编码蛋白的理论分子质量为66825.44 Da,等电点为7.947;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白存在6个N-糖基化位点、25个O-糖基化位点和28个磷酸化位点;系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒美国株属同一分支。     

弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

为了分析并预测弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1(Tg MAPK1)基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原及潜在药物靶点的可能性,试验从Gen Bank数据库获取Tg MAPK1基因序列,采用在线蛋白分析专家系统(http://ca.expasy.org/),结合DNAMAN、DNAStar等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等。结果表明:该基因全长为1 772 bp,编码区为133~1 731 bp,编码532个氨基酸。编码蛋白性质稳定,理论分子质量为58.376 ku。Tg MAPK1蛋白有5个跨膜区,有3个N端糖基化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个环腺苷酸蛋白激酶磷酸化位点、10个N端肉豆蔻酰化位点及1个酰胺化位点;无信号肽,二级结构以无规卷曲为主;Tg MAPK1基因主要存在于弓形虫虫体外膜上,有20个潜在的抗原表位。说明弓形虫Tg MAPK1基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA12的生物信息学分析

为分析并预测弓形虫致密颗粒蛋白GRA12基因编码蛋白的结构、功能以及其作为疫苗候选抗原的可能性,本研究从Gen Bank数据库获取GRA12基因序列,通过在线蛋白分析专家系统(Expasy)并结合GENERUNR、DNAStar、DNAMAN等生物信息学分析软件对GRA12序列的编码区进行分析、对该基因编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等信息预测。结果表明:该基因全长1 311 bp,编码436个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为47.8 ku,无信号肽,有6个跨膜区,14个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点、3个酪氨酸磷酸化位点、18个O-糖基化位点、3个乙酰化蛋白附着位点、1个酪氨酸硫酸化位点、1个潜在的N-糖基化位点、1个棕榈酰化位点,15个潜在的抗原表位。研究结果分析说明GRA12有潜力成为弓形虫疫苗候选抗原。     

1株Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了研究Ⅶ型新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）CY1株的进化情况,分析其遗传变异和基因功能,试验应用RT-PCR扩增NDV辽宁分离株CY1株的融合蛋白(fusion,F)基因,进行测序分析,构建系统进化树,并用生物信息软件对蛋白结构功能进行分析。结果显示,NDV F基因全长1662 bp,编码553个氨基酸。生物信息学分析结果表明,F蛋白的分子质量为58991.0 u,理论等电点为8.48,半衰期为30 h（哺乳动物类网状细胞）,不稳定系数31.62,脂肪指数为108.12,总平均疏水性0.174,最大疏水性为3.078,最小疏水性为-2.578,信号肽序列为第1-31位氨基酸残基,跨膜区结构分析结果表明该蛋白为跨膜蛋白,预测可能含有6个N-糖基化作用位点、9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、14个N-豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点、1个亮氨酸拉链、1个微体C端靶信号位点、1个双向核定位信号。系统进化分析结果表明,NDV CY1株与zj1株进化距离最近。     

山羊肌生成抑制素(MSTN)基因的克隆及生物信息学分析

试验对山羊肌生成抑制素(myostatin,MSTN)基因序列进行了克隆及生物信息学分析,旨在为该基因的深入研究提供理论依据。结果表明,山羊MSTN基因序列长1128 bp,编码375个氨基酸,GenBank登录号为GU183368。山羊MSTN蛋白序列与绵羊、猪、兔、马、人、牛、鼠同源性依次为93%、89%、88%、88%、88%、87%、85%,同源性较高,说明该基因高度保守;疏水性分析结果表明,该蛋白大多数氨基酸为疏水性氨基酸;蛋白跨膜结构及方向显示,从内向外和从外向内分别含有1个强跨膜螺旋区;信号肽预测显示,信号肽序列长度为70;亚细胞定位预测发现,该蛋白是一个Ⅱ型膜蛋白,大部分定位于高尔基体、质膜和内质网膜,内质网腔内也有少量分布;结构功能域预测发现N-肉豆蔻酰化位点3个,N端糖基化位点2个,蛋白激酶C磷酸化位点5个,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点5个,络氨酸激酶磷酸化位点1个,EF-hand 钙结合结构域1个,亮氨酸拉链1个,TGF 家族标记1个;二级结构预测显示,α螺旋占25.33%,β折叠占3.20%,随机卷曲占50.13%,延伸链占21.33%。