新疆石河子地区牛支原体的分离鉴定及药物敏感性分析

【目的】确定引起新疆石河子地区集约化牛场常发性肺炎的主要病原同时进行病原的体外药物敏感性分析。【方法】采集有典型咳嗽、流涕症状的牛鼻拭子10份和病死牛肺脏组织1份,用牛支原体特异性引物进行PCR检测,将检测为阳性的样本进行病原培养纯化,对纯化后的分离株菌落进行形态学观察、Dienes染色、生化试验及16S rRNA测序和进化分析,通过测定颜色变化单位(CCU)测定分离株生长曲线,并对分离株进行药物敏感性试验。【结果】PCR结果显示,10份鼻拭子中检测出7份牛支原体阳性样本,1份病死牛肺脏组织也检测为阳性;在涂有肺脏组织研磨液培养液的PPLO固体培养基上长出针尖状的菌落,纯化后分离株菌落形态为典型的煎蛋状;Dienes染色可见明显的深蓝色中心脐;生化试验结果显示,分离株不水解明胶、精氨酸、七叶苷,不发酵乳糖、葡萄糖和甘露醇,不分解尿素,可还原氯化三苯基四氮唑;16S rRNA测序结果显示,分离株与牛支原体国际标准株PG45相似性为99.7%,与国内牛支原体地方流行株XBY01、Ningxia-1、NM2012、Tibet-10的相似性最高,均为99.9%;生长曲线测定结果显示,分离株在培...     

宁夏地区牛支原体药物敏感性分析

[目的]提高牛支原体病治疗效果。[方法]应用微量肉汤稀释法对宁夏地区分离鉴定的74株牛支原体进行药物敏感性分析。[结果]恩诺沙星的MIC分布范围最小,MIC₅₀与MIC₉₀最小,其次是大观霉素、庆大霉素和卡那霉素;试验菌株对大观霉素的耐药率最低（12%）,其次为恩诺沙星（22%）,对庆大霉素和卡那霉素的耐药率最高且相同（36%）;肺分离株耐药性最强,关节液分离株次之,乳汁分离株最弱。[结论]恩诺沙星对牛支原体的体外抑菌效果最好,但易产生耐药性,应注意用药剂量和时长;肺分离株耐药性最强可能与呼吸道感染牛支原体的概率大且频繁使用抗生素有关。     

牛支原体新疆株的分离鉴定

为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。     

引起奶牛关节炎的牛支原体病原的分离鉴定

试验通过细菌分离培养及分子生物学诊断技术对一起引起奶牛关节炎的病原进行了鉴定。结果显示,该病原菌落形态为"油煎蛋样",牛支原体16S r RNA和uvr C均扩增出相应的片段,且16S r RNA和uvr C基因序列构建的系统发育树与牛支原体在同一分枝。说明引起该奶牛关节炎的病原菌为牛支原体。     

牛病细菌分离鉴定及药物敏感性试验探讨

近年来国家大力支持草食家畜发展,这在很大程度上促进了养牛业的发展,但由于犊牛贸易比较频繁、流动性大、养殖规模大等,使得牛极易患上流行病症.牛细菌性疾病是牛的常见病,给养牛业带来了不小的阻碍,本文笔者以牛巴氏杆菌病、奶牛乳房炎为例,对牛病细菌分离鉴定与药物敏感性试验相关内容,做了简单的分析论述.     

—株牛变形杆菌的分离鉴定及其药物敏感性研究

从重庆市某肉牛场病牛关节液中分离到1株细菌,经细菌形态和培养特性观察、生化试验、小鼠攻毒试验及细菌16SrRNA基因序列分析,判定该菌为变形杆菌。药敏试验表明,分离菌株对头孢呋辛、丙氟哌酸等药物敏感。     

一株牛支原体的分离鉴定及致病性初步研究

对采集到的疑似牛支原体肺炎肺组织病料进行病原的分离,并对分离株进行形态学、生化和分子生物学鉴定,结果显示成功分离获得1株牛支原体,命名为NM001.该分离株的菌落形态呈典型的"荷包蛋状",不能发酵葡萄糖,不能水解精氨酸,不分解尿素.PCR能够扩增出牛支原体特异的P48基因条带,16S rRNA基因序列与Ningxia-...     

广东规模化鸡场死鸡胚中鸡毒支原体的分离鉴定、致病性及药物敏感性

旨在从广东某规模化鸡场死鸡胚进行鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的分离,并进行遗传进化分析、致病性及药物敏感性研究。本研究从广东某规模化鸡场的带菌死胚卵黄组织中分离禽支原体,通过菌落观察、血清学试验、16S rRNA支原体通用引物序列鉴定等方法,对分离的菌株进行种属鉴定,同时将分离的毒株对鸡胚和SPF鸡进行攻毒试验及抗菌药物敏感性试验。结果显示：显微镜下菌落呈典型的“荷包蛋”状。平板凝集试验显示其与MG阳性血清有凝集反应,与MS阳性血清不反应;16S rRNA序列测序发现各分离株与MG相似性达99.9%,因此确定分离株为MG。将各分离株感染7日龄SPF鸡胚,结果显示感染鸡胚大多于临近出壳时死亡;感染3周龄的SPF鸡,3周后解剖发现鸡气囊发生显著病理变化,说明其具有较强致病力;药物敏感性试验结果显示,5株分离株对盐酸沃尼妙林、多西环素、泰万菌素及泰妙菌素有较高敏感性,对替米考星、泰乐菌素、恩诺沙星、红霉素、吉他霉素、林可霉素呈现出不同程度耐药性。综上,从广东某规模化鸡场死鸡胚中成功分离到5株MG分离株,各分离株均可引起红细胞凝集,导致鸡胚死亡,对SPF...     

不同地区鸡毒支原体的分离鉴定及药物敏感性研究

【目的】了解中国不同地区鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）的流行和耐药情况,为禽支原体病的监测与防控提供科学依据。【方法】在广东、福建和安徽3个省份疑似MG感染的养殖场采集的43份气囊样品中分离培养和纯化MG流行菌株,并对其进行培养特性观察、生化及染色鉴定、血清学特异性鉴定、PCR测序分析、致病性试验和对常见抗菌药物敏感性试验。【结果】分离到3株疑似MG,均可使培养基颜色变黄,在固体培养基上呈典型煎蛋样菌落,可发酵葡萄糖,不水解精氨酸,不能利用尿素,符合MG培养特性。姬姆萨染色观察菌体形态、血清学特异性鉴定结果进一步证实分离株为MG。mgc2基因测序结果显示,3株分离株与强毒代表株亲缘关系更近。致病性试验结果显示,3株分离株与MG感染临床症状一致,发病率为70%~90%,致病力较强。药物敏感性试验结果显示,3株分离株均对恩诺沙星、替米考星、土霉素、氟苯尼考耐药,对泰万菌素和沃尼妙林均敏感,对大观霉素、金霉素、泰乐菌素和泰妙菌素的敏感性具有地域差异：福建株对大观霉素表现明显耐药,安徽株对泰妙菌素表现耐药,而广东株对大观霉素、金霉素和泰妙菌素均较敏感。【结论】本试验成功分离到3株MG,致病力较强,且均存在一定程度耐药,对药物的敏感程度有地区性差异,今后仍需加强各地区MG的药物敏感性监测,减少耐药性的产生与扩散。     

规模化猪场猪源沙门氏菌的分离鉴定及药物敏感性分析

为了解贵阳地区某规模化猪场致腹泻猪源沙门氏菌的流行状况和耐药情况,采集腹泻仔猪肠内容物进行细菌分离培养、生化试验、PCR检测、动物致病性试验和药敏试验.结果表明,从腹泻仔猪肠道内容物中分离到两株沙门氏菌,分别为鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌;生化试验显示均有沙门氏菌特异性特征;按照4.1×109 cfu/mL剂量给小鼠...     

宁夏某肉牛场牛支原体分离鉴定及病理组织学观察

为了分离鉴定宁夏某肉牛场牛支原体和分析该病原对靶器官的损伤,采用Thiaucourt's液体筛选培养基和固体培养基进行病原分离,设计牛支原体16SrRNA通用引物和uvrC特异性引物进行基因序列扩增并测序,使用DNA Star软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比较,采用MEGA6.0软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)依据16SrRNA和uvrC序列构建分离株系统发育树并进行遗传进化分析,采用石蜡切片,HE染色,病理组织学观察。结果表明,病原菌落呈油煎蛋样,16S rRNA和uvrC扩增片段与阳性对照一致,16S rRNA和uvrC基因序列构建的系统发育树与牛支原体在同一分支;肺组织结构消失,部分肺泡腔实变、塌陷,局灶性肺出血,肺泡腔内可见炎性细胞浸润;肺泡隔增厚、出血,肺泡内有少量脱落的上皮细胞;肺泡壁断裂,肺泡腔可见红色的炎性渗出物,有纤维结缔组织增生。     

内蒙古地区乳样中牛支原体的分离及PCR鉴定

为检测内蒙古地区某牛场患乳房炎的奶牛乳样中是否存在牛支原体,同时建立直接提取乳样中牛支原体DNA进行PCR检测的方法,本研究无菌采集乳房炎乳样,通过支原体的分离培养、形态学观察和生化试验,初步鉴定分离株为牛支原体,然后提取液体培养基菌体DNA进行牛支原体特异性PCR鉴定,同时,采用Chelex-100法直接提取原乳样中菌体DNA进行PCR鉴定,并测序分析扩增片段序列。液体培养物提取DNA与Chlex-100法直接提取原乳样菌体DNA进行特异性PCR均扩增出目的条带,该片段序列与GenBank中牛支原体oppD/oppF基因的同源性达到99.8%,证实分离株为牛支原体。说明Chlex-100法可直接提取乳样中牛支原体DNA进行快速PCR鉴定。     

致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及oppF基因序列分析

本研究旨在调查新疆喀什某规模化奶牛场的犊牛死亡原因,并确定病原体.无菌采集3份因肺炎死亡的犊牛肺脏病料样品.采用牛支原体专用液体培养基和1.0%牛支原体琼脂固体筛选培养基从3份病死犊牛肺脏病料中分离得到2株牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis),分别命名为M.bovis-NJ-1和M.bovis-NJ-2.通过菌落形态学观察、特异性PCR和oppF测序比对对分离株进行鉴定.结果显示,2个分离株在固体培养基上的菌落呈现典型的"煎蛋状",且Dienes染色特点符合牛支原体菌落着色特征,中心呈深蓝色;PCR能扩增出牛支原体特异的448 bp目的片段;2个分离株的oppF基因序列与牛支原体国际标准株PG45的同源性分别为96.7%和95.3%.结果表明,引起犊牛发病死亡的病原是牛支原体,本研究为犊牛支原体肺炎的快速诊断和防制提供依据.     

牛支原体药物敏感性试验

为了解牛支原体的体外药敏试验,以指导临床合理使用抗生素,对临床分离鉴定的3株牛支原体,采用微量稀释法测定其对环丙沙星、恩诺沙星、红霉素和诺氟沙星的最低抑菌浓度(MIC),重复3次,取平均值。结果表明,牛支原体对环丙沙星的MIC抑菌范围为64μg/mL～128μg/mL,对恩诺沙星的MIC值为4μg/mL～8μg/mL,对红霉素的MIC值为2μg/mL～4μg/mL,对诺氟沙星的MIC值在8μg/mL～16μg/mL之间。牛支原体对红霉素的耐药性最低,其次是恩诺沙星、诺氟沙星,对环丙沙星的耐药性最高。     

牛支原体单克隆抗体的制备与鉴定

以牛支原体(Mycoplasma bovis)湖北分离株HB0801作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选出了6株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞株,分别生产腹水并对单抗进行了纯化和特性鉴定。经亚型测定,这些单抗都属IgG类。腹水ELISA效价在1×10⁵~1.6×10⁶。ELISA特异性分析结果表明,6株单抗与临床分离的牛支原体菌株以及ATCC标准株PG45都显阳性反应,但与牛的其他常见病原菌如多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌等都显阴性反应。所有制备的单抗都与无乳支原体有交叉反应,其中两株单抗1A5和1C11只与无乳支原体有交叉反应,与其他支原体无交叉反应。经Western blotting验证,6株单抗分别识别牛支原体全菌蛋白中的不同条带,说明分别针对不同的蛋白抗原。这些牛支原体单克隆抗体为后期建立牛支原体检测方法及致病机理研究奠定了良好基础。     

Preparation and Identification of the Monoclonal Antibodies against VspX Protein in Mycoplasma bovis strain HB0801

To obtain the monoclonal antibody (McAb) against VspX protein of Mycoplasma bovis (M. bovis),VspX gene was amplified, expressed and purified. Then, BALB/c mice were immunized subcutaneously three times with the purified recombinant VspX (rVspX) mixed with QuickAntibody-Mouse 5W adjuvant. Three days after the last injection, spleen cells were collected aseptically, and fused with SP2/0 myeloma cells in the presence of polyethylene glycol. By the clone selection, five stable hybridomas against VspX protein were obtained, separately named as 1A8, 3A3, 3C12, 3H9 and 4D11. Antibody titers in cell supernatant were from 1:1×10⁴ to 1:2×10⁵, while from 1:1×10⁵ to 1:8×10⁵ in ascites of mice by indirect ELISA. The subtypes were determined to be IgG1 and IgG2b class, and all light chains were κ chain. The affinity constant of McAb 3H9 and 4D11 were 6.3×10⁹ and 7.8×10⁹, respectively, and they belonged to high-affinity antibodies. Western blotting results showed that all of five McAbs could specifically react with M.bovis, however, McAb 4D11 could not react with Mycoplasma arginini PG2 and Mycoplasma mycoides subsp. PG3. Flow cytometry showed that McAb 4D11 reacted with surface VspX of M. bovis in a dose-dependent manner. Indirect immunofluorescence assay demonstrated that 4D11 McAb was able to detect rVspX protein binding to embryonic bovine lung cells. In the present study, McAbs against rVspX protein had been successfully prepared, which provided a basis for future researches about the function of VspX protein and the pathogenesis of M. bovis.