绵羊痘病毒甘肃流行株糖蛋白基因orf118的克隆及序列分析

从甘肃景泰疑似羊痘患病绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,利用PCR技术,克隆糖蛋白orf118基因.比较分析表明,该基因由516个核苷酸组成,编码171个氨基酸,相对分子质量为19 500,其碱基组成极不平衡,其中A T含量占72.48%,G C含量仅占27.52%.甘肃景泰株orf118基因同绵羊痘病毒TU-V02127 株之间的核苷酸同源性最高达99.8%,氨基酸的同源性为100%;与疙瘩皮肤病病毒肯尼亚株和山羊痘病毒G20-LKV 株之间的同源性分别为96.5%和94.8%.结构预测结果显示,orf118蛋白为分泌蛋白,具有2个N键连结糖基化位点和1个跨膜区.以上结果表明,orf118蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗和诊断价值.     

绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger基因的克隆表达及序列分析

【目的】对绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger蛋白的基因进行克隆,表达以及序列分析,初步探究绵羊痘病毒RING finger蛋白是否具有E3泛素连接酶活性,为阐明其在绵羊痘病毒感染过程中对泛素蛋白酶体系统的调控作用奠定基础.【方法】以绵羊痘病毒甘肃古浪株DNA为模板,通过PCR扩增RING finger基因.利用Pfam数据库、DNAstar等软件进行序列及遗传进化分析;将RING finger基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-SPPVRFP重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行SDS-PAGA和Western-blot分析.【结果】绵羊痘病毒RING finger基因由723个核苷酸组成,编码的240个氨基酸的分子量约为28.5 ku,具有RING finger结构域.不同羊痘病毒株间RING finger基因核苷酸序列同源性高达99.2%,氨基酸序列同源性高达98.3%.不同的RING finger蛋白都含有8个保守的半胱氨酸和组氨酸.SDS-PAGA分析显示,重组SPPVRFP大小约为55 ku,Western-blot分析显示,重组SPPVRFP不能与绵羊痘病毒阳性血清反应.【结论】成功克隆、表达并纯化了绵羊痘病毒RING finger基因,对SPPV GS-GL株RING-finger蛋白进行序列分析,推测其可能具有E3泛素连接酶活性.     

绵羊痘病毒RPO30基因的克隆及序列分析

[目的]对绵羊痘病毒RPO30基因进行克隆,并对所得序列进行结构和功能预测。[方法]PCR扩增RPO30基因,克隆到pMD18-Tsimple载体并转化DH5a大肠杆菌;经蓝白斑筛选挑选白斑制备质粒,阳性克隆经双酶切和PCR鉴定后送测序。利用生物信息学方法对所克隆的分子进行序列分析和结构预测。[结果]成功克隆了RPO30基因,克隆的SSPVRPO30基因ORF为585bp,编码193个氨基酸,阅读框内有一个HindIII酶切位点,测序结果与GenBank数据库中不同痘病毒毒株之间同源性存在着明显区别。生物学软件分析表明RPO30蛋白质氨基酸4～12、18～26、50～61、68～92和176～190位之间区域形成活性中心的可能性较大,选择这些区域进行作用可能会造成该基因产物酶的失活,从而高效抑制病毒的复制。[结论]本研究将RPO30结构和功能的进一步研究奠定一定的基础。     

绵羊痘病毒新疆株的分离及结构蛋白P32基因序列分析

[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变.     

鸡痘病毒ORF073基因克隆及原核表达

根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定。目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致。克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白。     

犬冠状病毒V1株膜蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中报道的CCVInsavc 1株核蛋白基因(M)序列,用特异性引物对分离的CCVV1野毒株进行了RT PCR扩增,将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM T连接得到重组质粒pTM,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,该基因全长为789bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。与CCV标准毒株Insavc 1M基因相比,两者核苷酸的同源性为92.1%;推导的氨基酸序列同源性为90.9%,差异主要发生在该蛋白的N端前1/3区域内。在推导的M蛋白氨基酸序列中,发现了3个明显的疏水区,提示该蛋白可能是一个反复跨膜的蛋白;在N端15～17,38～40,234～236位氨基酸存在3个潜在的N 联糖基化位点,可能是形成该蛋白表面抗原决定基的位点。另外,推导蛋白氨基酸序列的疏水性和抗原表位与Insavc 1株M蛋白存在一定差异,提示两者免疫原性可能有差别。     

真鲷虹彩病毒辽宁株跨膜蛋白(ORF049L)基因的克隆及表达

克隆了真鲷虹彩病毒辽宁株(RSIV-LN09)跨膜蛋白(ORF049L)基因,利用生物信息学方法,对该基因编码蛋白的跨膜区及B细胞抗原位点等特征进行了分析。随后将该序列连接至pET-28a表达载体中,成功构建了pET-28a-ORF049L原核表达质粒。将表达质粒转化至BL21(DE3)菌株后,经IPTG诱导获得大量携带组氨酸标签的融合蛋白。该融合蛋白经变性后采用镍层析柱进行亲和纯化,纯化蛋白再经SDS-PAGE和Western blot分析,确认获得了相对分子质量约为17 000的高纯度重组蛋白His-049L。本研究结果为病毒跨膜蛋白单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础。     

真鲷虹彩病毒辽宁株跨膜蛋白(ORF049L)基因的克隆及表达

克隆了真鲷虹彩病毒辽宁株(RSlV-LN09)跨膜蛋白(ORF049L)基因,利用生物信息学方法,对该基因编码蛋白的跨膜区及B细胞抗原位点等特征进行了分析.随后将该序列连接至pET-28a表达载体中,成功构建了pET-28a-ORFF049L原核表达质粒.将表达质粒转化至BL21 (DE3)菌株后,经IPTG诱导获得大量携带组氨酸标签的融合蛋白.该融合蛋白经变性后采用镍层析柱进行亲和纯化,纯化蛋白再经SDS-PAGE和Western blot分析,确认获得了相对分子质量约为17 000的高纯度重组蛋白His-049L.本研究结果为病毒跨膜蛋白单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础.     

PRRSV辽宁分离株ORF3基因的克隆与序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。     

绵羊IGFBP-1基因的克隆及序列分析

试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-1基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明,IGFBP-1基因的CDS序列为792 bp,编码263个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为97%、76%和74%,氨基酸序列同源性分别为97%、69%和71%,Gen Bank登录号为FJ589639.1;IGFBP-1基因的氨基酸分子量为27.8 k D,理论等电点(p I)为5.99;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与鸡、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-1基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有一个信号肽、一个跨膜区、16个磷酸化位点、6个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为61.98%、24.33%、13.69%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊IGFBP-1基因的功能奠定基础。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南09分离株ORF5基因的克隆及结构分析

参照GenBank上登录的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)美洲型AF494042株ORF5基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR扩增出PRRSV河南09分离株(HN-09)的ORF5基因,经与pGEM-T Easy载体连接后,筛选出阳性重组质粒进行序列测定,并利用DNASTAR软件对序列进行分析.结果表...     

猪源冠状病毒ORF3和ORF7的克隆及特性分析

参照GenBank中Purdue株全序列对TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)TS株的ORF3和ORF7各设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增分别获得了1 487 bp和516 bp大小的两个片段,与预期结果大小相符.TS株与CHV株、Puedue株、BW021898B株和KT2株的ORF3a核苷酸序列同源性分别为99.1%、93.0%、95.9%、94.4%,相应的氨基酸同源性分别为97.3%、87.8%、93.2%、91.8%,TS株与CHV株、Puedue株、BW021898B株和KT2株的ORF3b核苷酸序列同源性分别为99.5%、98.5%、97.0%、97.8%,相应氨基酸的同源性分别为98.4%、96.3%、94.3%、95.8%,而TS株与PRCVIA1894株的ORF3b核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6%和93.9%.TS株ORF7没有发生缺失且和其他毒株有很高的同源性.结果表明:TGEV非结构蛋白高变区在ORF3a第192个碱基至终止密码子之间,TGEV和PRCV在编码ORF3b氨基酸的数量和RNA酶结合位点上有一定的差异.     

烟草丛顶病毒ORF3的克隆及原核表达

利用RT-PCR方法,自烟草丛顶病毒(Tobacco bush topvirus,TBTV)龙陵分离物(TBTV-YLLi)的RNA中扩增出ORF3目的片段,并克隆到pMD18-T载体上进行序列分析.结果表明,TBTV-YLLi的ORF3全长714 bp,与TBTV其他分离物的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为98.3%~98.6%和95.4%~95.8%;与同属的花生丛簇病毒(Groundnut rosette virus,GRV)、豌豆耳突花叶病毒2号(Pea enation mosaic virus-2,PEMV-2)和胡萝卜拟斑驳病毒(Carrot mottle mimic virus,CMoMV)的核苷酸相似性分别为65.1%、61.6%和49.7%,氨基酸相似性分别为36.4%、34.6%和16.5%.将ORF3克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得的重组子pET28-ORF3转化大肠杆菌BL21-plysS,使用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养4 h时,该融合蛋白表达量最高.融合蛋白经Ni2+亲和柱层析纯化后,SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白相对分子质量约为35 000,与预计的相对分子质量大小相一致.     

PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。     

15株猪流行性腹泻病毒河南株ORF3全基因的克隆与序列分析

为调查近年来河南省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,从2015—2017年河南部分地区猪场患腹泻仔猪的小肠组织及内容物中克隆了15株PEDV ORF3基因,并对其进行了序列测定及分析。结果显示,15株PEDV河南株 ORF3 基因序列长度均为675 bp。15株PEDV分离株之间核苷酸同源性为94.4％～99.9％,与经典毒株CV777、弱毒株attenuated DR13核苷酸同源性分别为95.7％～97.0％和96.6％～98.1％。遗传进化分析显示,PEDV分为两大群,3株分离株属于G1群,单独成一个小的分支。其余12株分离株与往年河南流行株、大部分国内分离株、韩国、日本、美国及法国毒株位于G2群,亲缘关系较近,而与经典毒株CV777亲缘关系较远。表明河南省PEDV有变异和进化趋势,为河南省PED的防控和疫苗的研制提供技术支持。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5,ORF7基因的克隆

为了从分子水平了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF7基因的特征,并为PRRSV的遗传进化和分子变异研究提供资料。对宁夏地区流行的PRRSV进行采样分析,运用RT-PCR技术分别扩增了PRRSV NX-1/2008毒株囊膜蛋白基因ORF5与衣壳蛋白基因ORF7,并对其进行了克隆,随后利用DNAS-TAR生物软件进行了同源性比对和进化分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008毒株的ORF5,ORF7基因均与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,ORF7的氨基酸同源性则达到了100%。与空间距离较远的JXa-1/2007毒株相比,NX-1株的ORF5基因在中和抗体决定区196位上发生突变,而与相距较近的HUB-1/2006,CH-1 a/2001等毒株相比较,则无此突变;与CH-1 a/2001毒株相比,GP5蛋白的免疫原性核心位点B 39位的F→I,在诱导中和抗体起重要作用的33位糖基化位点N→S,同时,诱骗位点A(30~38氨基酸)的32,33和35位氨基酸都发生了突变。NX-1株的ORF7基因与国内CH-1 a/2001等低致病性毒株间的突变有69%位于抗原决定区,而其中有56%是高致病性毒株的主动突变。研究表明,分离的PRRSV高致病性毒株与低致病性毒株的抗原性在基因组上有较大范围的变异,且这种变异可能还主要位于免疫决定区。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因的克隆与表达

用RT-PCR方法从河南分离的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)变异株(HN07-1)中扩增ORF5全长基因,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该序列与标准美洲株VR-2332同源性为89%,与我国早期分离的BJ-4株同源性为88%,与HB-1、JXAI变异株同源性为96%和99%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,成功表达了41.5 kD的融合蛋白。