赤羽病毒G1基因的真核表达及抗原性检测

通过RT-PCR获得赤羽病毒（AKAV）OBE-1株的Gl基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭我体Bacmid DNA同源重组,获得了重组杆状病毒DNA,用CELLFECTIN介导其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BAC-G1P1。SDS-PAGE结果表明,感染BAC-GIP1后的Sf9昆虫细胞表达可溶形式的120ku目的蛋白,其大小与预期相符。Western blot和间接免疫荧光试验显示表达产物具有良好的免疫学活性。     

鸡传染性支气管炎病毒DB株核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用PT－PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）DB株的核蛋白基因，并对其序列进行了测定，DB株IBV的核蛋白基因长度为1230bp，编码蛋白由409个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较，发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue-DB-N，将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，经过3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应（PCR）鉴定，获得重组杆状病毒rBac-DB－N。SDS－PAGE分析和Western blot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因基因在重组杆状病毒感染原Sf9昆虫细胞内获得表达，融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19．4％左右。     

新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达

为构建杆状病毒转移载体，通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的StuⅠ位点和NP基因上的XbaⅠ位点进行突变，扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAeAB4上，F基因和M基因均在p10启动子的操控之下，NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游，构建重组杆状病毒转移载体pAeAB4-F-NP-M-HN。pAeAB4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBae-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞，72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示：M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达，大小与预期结果一致；感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒，并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达

将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达和纯化

为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现...     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD糖蛋白的单链抗体在昆虫细胞中表达及活性检测

为了获得具有生物学活性的牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV） gD蛋白特异性单链抗体,试验采用PCR方法扩增杂交瘤细胞的cDNA单链抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因,将单链抗体基因克隆至杆状病毒载体pFB-LIC-Bse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒rBacmid-VH-VL,将重组杆粒rBacmid-VH-VL转染至Sf9细胞中获得携带单链抗体基因的重组杆状病毒。该重组杆状病毒在Sf9细胞中表达了分子质量约为30 ku的单链抗体蛋白。Western blotting结果显示,重组单链抗体蛋白能被His标签抗体特异性结合,也能特异性结合gD蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,该单链抗体蛋白能够识别感染牛肾细胞MDBK中的IBRV。本研究在昆虫细胞中成功表达了具有识别IBRV的gD蛋白特异性单链抗体,为牛传染性鼻气管炎的诊断与治疗奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒Holte株S1基因在昆虫杆状病毒系统的表达及其抗原性分析

为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆茵中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒.将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性.本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础.     

H7亚型禽流感病毒HA基因在杆状病毒系统中的表达

利用PCR反应，以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中，转座DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆，然后提取基因组Bacmid，转染Sf9昆虫细胞，得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞，细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实，密码子优化的H7HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达，且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

猪圆环病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中表达形成病毒样颗粒的研究

本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）PCV2b的ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMⅠPPH启动子控制下的多克隆位点,构建的质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-cap。将rBacmid-cap转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验证明目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞后,用Western blot在细胞培养上清中检测到了目的蛋白,并于d 5达到表达高峰。电镜观察结果显示上清中的目的蛋白可以装配成直径约为17 nm的病毒样颗粒。病毒样颗粒在培养上清中的大量存在,为目的蛋白进一步的分离和纯化提供了便利,也为PCV2基因工程疫苗的产业化奠定了基础。     

Cloning and kinetics of expression of Brucella abortus heat shock proteins by baculovirus recombinants

In an effort to develop genetically engineered Brucella abortus (BA) vaccines, the genes encoding heat shock proteins (HSPs) GroEL, GroES, and HtrA were cloned and expressed in the BAC-TO-BAC Baculovirus System, and the kinetics of protein expression were analyzed using various insect cell lines in suspension cultures, different cell densities in suspension cultures, multiplicities of infection and recombinant virus replication times. Trichoplusia ni cells expressed only BA HtrA, but Spodoptera frugiperda (Sf9) cells expressed all three recombinant proteins. The best GroEL expression was achieved by infecting 2x10(6) Sf9 cells/ml with an MOI 10 of recombinant virus and harvesting the cells after 96h of virus replication. GroES and HtrA were best expressed when infecting 2x10(6) Sf9 cells/ml with an MOI 1 of recombinant viruses and harvesting the cells after 120h of virus replications. Under these conditions BA recombinant HSPs were expressed as follows: GroEL at 16% of the total cellular proteins (105microg/ml concentration); GroES 2% (15.25microg/ml); and HtrA 8% (84.48microg/ml). This is the first report of cloning and expression of BA genes in the baculovirus system.     

鸡传染性喉气管炎病毒DNA疫苗免疫效果观察

将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株ｇＢ、ｇＣ和ｂＤ基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组肌肉注射雏鸡，攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，重组质粒诱导了免疫应答，免疫保护率为７９％，该基因疫苗可以作为预防ＩＬＴ的一个补充。     

鸡传染性喉气管炎病毒烟台株gB基因的序列测定及其结构功能分析

研究以鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)烟台株为模板,PCR扩增出1条约2.7kb的gB基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体中。序列测定显示,gB基因长2622bp,包含完整的阅读框架。序列比较分析发现,烟台株和王岗株、河北株的gB基因核苷酸序列与SA2株的相比均在第89位上缺失1个碱基G,而在第102位核苷酸处插入1个碱基A,从而引起氨基酸序列中第29～32位5个氨基酸的移码突变。烟台株还有另外7个碱基发生突变,使得其gB基因与河北株、王岗株、疫苗株的gB基因核苷酸同源性分别为99.8%、SA299.7%和99.6%,氨基酸的同源性分别为99.4%、99.4%、98.9%,表明不同ILTV毒株之间gB基因是非常保守的。     

禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。     

奶山羊IL-1β在Sf9细胞中的表达

将CalL-1β基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒载体pFastBac-HTb中,构建转移载体pFastBac-HTb-CaIL-1β,转座到宿主菌DH10 Bac中,在Kan+/Gm+/Tet+/X-gal/IPTG LB平板上筛选白色菌落,碱裂解法提取质粒即为穿梭载体Baemid-CaIL-1β,转染Sf9细胞...