鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化

为提高鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan荧光定量PCR方法的敏感性和简化反应条件,本研究在前期建立的TaqMan荧光定量PCR方法的基础上,设计一条特异性的反转录引物,优化反应体系,建立了简便、快速、敏感的TaqMan荧光定量PCR方法。该荧光定量PCR方法最低检测限为10拷贝,敏感性是未优化的荧光定量PCR方法的5倍、是普通PCR方法的100倍,并且该方法对DTMUV的最低检测限是0.01半数鸡胚致死量(ELD50)。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法好。通过该优化的荧光定量PCR方法检测其它常见的鸭病病毒的DNAs或RNAs,证明了该方法特异性好。对现地60份疑似DTMUV的样品进行检测,用该方法检出57份样品为阳性,明显高于普通PCR,并且在区分35Ct值左右样品试验中敏感性优于未优化的荧光定量PCR方法。该优化的DTMUV TaqMan荧光定量PCR方法更适用于DTMUV的快速定量流行病学诊断。     

鸭坦布苏病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）基因组（登录号：JX273153）保守基因序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,以DTMUV重组质粒为阳性标准品模板,建立了快速、准确检测DTMUV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法特异性好,仅能在DTMUV样本中检出荧光信号,与其他病原不发生交叉反应;敏感性高,最低检测限可达25 copies/μL;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与CT值之间的线性关系表达式为Ct=–3.323×Lg（conc）+43.70,相关系数R2＝0.997,扩增效率E＝100%,DNA在2.5×101～2.5×107个拷贝数内检测曲线有良好的线性关系。对来源于江苏省和安徽省的29份疑似鸭坦布苏病毒感染的病鸭组织进行荧光定量RT-PCR检测,结果有27份呈现阳性,阳性检出率为93.10%,比常规RT-PCR的敏感性高。研究结果表明,该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测,可用于DTMUV的临床检测和分子流行病学调查。     

鸭坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为建立鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测方法,对DTMUV的NS5基因设计特异性引物和MGB探针,使用RT-PCR扩增NS5基因并将其连接到pEASY?-T1载体上构建重组质粒,提取阳性重组质粒作为qRT-PCR阳性模板绘制标准曲线,用SYBR Green I法检测MGB探针法qRT-PCR的引物是否有非特异性扩增,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样品检测。结果显示：MGB探针法qRT-PCR标准曲线的相关系数为0.999 3,其引物没有非特异性扩增;对于其他阳性样本,如鸭肝炎病毒（DHV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）等抗原无扩增曲线,只能检出DTMUV;qRT-PCR敏感性可达3×102 copies/μL,是普通RT-PCR的10 000倍;批内和批间重复性试验变异系数（CV）为0.08%~0.49%,均小于0.5%。从云南省不同地区采集20份临床出现产蛋下降症状的病鸭组织,应用试验建立的qRT-PCR方法检出12份阳性样品,而普通RT-PCR检出10份,两者的阳性率分别为60%（12/20）和50%（10/20）。结果表明,本试验成功建立了基于DTMUV NS5基因的MGB探针qRT-PCR检测方法,其标准曲线线性关系显著,特异性强,与其他禽源性病原无交叉反应性,敏感性和重复性良好,敏感性和阳性检出率较普通RT-PCR高,更适合于DTMUV感染的临床诊断和流行病学调查。     

鸭坦布苏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法的建立

根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV) NS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103～2.74×10 7拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系.扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52％～1.48％,组间变异系数0.71％～2.21％.检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h.     

鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能快速检测鸭坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）的分子生物学方法,从GenBank中下载了51个具有代表性的黄病毒全基因组序列及白洋淀病毒等5个禽源黄病毒株E基因序列,进行了黄病毒E基因序列分析,应用Primer 5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为549 bp,进行了TMUV RT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了TMUV RT-PCR检测方法应用该方法对收集的14份临床疑似蛋鸭鸭坦布苏病毒病发病样品进行了检测,共检出6份TMUV核酸阳性样品,检出率达42.86％。结果表明,该方法可用于水禽坦布苏病毒病的临床快速诊断、检测及流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。     

鸭坦布苏病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用

为建立一种快速的鸭坦布苏病毒病原检测方法,本研究根据GenBank上登录的鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测DTMUV的RT-PCR诊断方法。该方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、鸭肠炎病毒等常见鸭病的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的DTMUV,将为DTMUV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

一种基于荧光探针技术的鸭坦布苏病毒核酸检测方法的建立

为建立一种鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR核酸检测方法,特针对鸭坦布苏病毒E基因的保守片段设计特异性引物和探针,在鸭坦布苏病毒核酸层面和合成基因质粒层面,经一系列优化调试完成方法初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性、标准曲线、扩增效率等方面进行了验证。结果显示：该方法特异性100%;敏感性为10copies/μL;重复性CV值在0.07%～0.65%区间;标准曲线相关系数为0.9995,扩增效率为99.0%。综上所述,本试验成功建立了一种性能良好的鸭坦布苏病毒荧光探针RT-PCR核酸检测方法,可为DMTUV的临床诊断和流行性病学调查提供一种技术支撑。     

应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒

鸭坦布苏病毒是新发现的一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的黄病毒。目前尚无可靠的快速诊断方法用于该病毒的检测。本研究根据鸭坦布苏病毒E基因序列,设计了2对重叠引物P1、P2和P3、P4,建立了检测鸭坦布苏病毒的套式RT-PCR方法,该套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍。采用该方法对安徽省、河北省、山东省、浙江省、上海市等地发病鸭场的63份样品进行了检测,阳性检出率为48/63（76.2%）,而病毒分离率仅为13/63（20.6%）。由此表明,与其他方法相比较,本试验所建立的套式RT-PCR方法具有快速、敏感、特异优点,可用于鸭坦布苏病毒的流行病学调查及病毒的检测。     

鸭黄病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据鸭黄病毒E蛋白基因序列设计了1对特异性引物和TaqMan探针,建立了实时荧光定量RT-PCR检测鸭黄病毒的方法.根据舍鸭黄病毒目的扩增片段的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线(y=-3.39 X+43.18,r=0.973).该方法具有特异性,对鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、腺病毒、鸭瘟病毒、猪乙脑病毒的核酸都没有扩增反应.敏感性试验显示,建立的此方法最低可检出1.9个TCID50病毒核酸.该方法对5只健康雏鸭人工感染86 h后的组织器官样品(盲肠扁桃体除外)的检测结果均为阳性,与病毒分离鉴定的阳性符合率为100％.结果表明,该方法真实可靠,而且从核酸提取到报告检测结果耗时不超过3h,为鸭黄病毒病提供了一种敏感特异的定量检测方法.     

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

The study was conducted to establish the duplex Real-time PCR assay for detecting both duck tembusu virus (DTMUV) and duck plague virus (DPV). According to the sequences of DTMUV E gene and DPV UL6 gene in GenBank, two sets of specific oligonucleotide primers for DTMUV and DPV along with two TaqMan probes were designed. The duplex Real-time PCR assay was developed through optimization of reaction conditions and validation of specificity, sensitivity and repetitiveness of the method. The sensitivity of the assay were both 100 template copies for DTMUV and DPV. There was no specific bands of the same sizes were amplified from other duck pathogens, such as duck Newcastle disease virus, duck hepatitis virus, muscovy duck parvovirus, duck circovirus, H9 subtype avian influenza virus, egg drop syndrome virus. This duplex Real-time RT-PCR assay is a sensitive, quick, specific and quantitative test for detection of DTMUV and DPV, and will be useful for the control of these viruses in ducks.     

猪细小病毒4型Taq Man荧光定量PCR方法的建立与应用

根据GenBank中发表的猪细小病毒4型(PPV4)全基因组序列,针对其结构蛋白VP2基因的保守序列,设计合成特异性引物及TaqMan探针,以VP2克隆质粒为标准品,通过对探针浓度、引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度以及退火温度进行调整,建立了PPV4的TaqMan荧光定量PCR.反应条件优化后,该方法在6.73×10...     

实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立与应用

建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测禽白血病病毒(ALV)。选取ALV病毒的LTR序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有ALV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。阳性标准品在3.0×102~3.0×107个拷贝共6个数量级的范围内,定量PCR反应有"S"型扩增曲线,检测灵敏度最低为30个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡传染性贫血病毒和马立克病病毒核酸都没有扩增反应。实时定量PCR检测ALV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。     

H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达10²拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。     

基于宏基因组学的鸭源样本中坦布苏病毒检测方法的建立

利用二代高通量测序技术建立检测鸭源样品中坦布苏病毒的方法。首先将样品过滤和经核酸酶处理,再利用等温链位移扩增(SPIA)技术快速制备样品总cDNA,最后经磁珠纯化和文库构建后,通过Ion Torrent进行高通量测序获得基因组信息。结果显示,通过SPIA扩增和核酸文库制备的优化,可从微量病原样本中获得327pmol/μL的核酸文库样本。Ion Torrent测序共获得1 725 436条reads,约6.2M数据,平均109bp。数据拼接并Blast发现,病原样品的核酸序列可注释鸭坦布苏病毒全部基因组数据,与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列的同源性为100%。将所测病毒序列与其他5种黄病毒科成员进行同源性比对,发现与近3年发生在我国的鸭坦布苏病毒同源性最高,在98%以上。且NS基因进化树分析与鸭坦布苏病毒处于同一分支上,符合鸭坦布苏病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序检测方法,可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。     

猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究在CSFV 5'端非编码区设计一对引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的重组质粒为标准品,建立了一种检测CSFV的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,可特异地检测CSFV,该方法在101～107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度可达10拷贝/μL,重复...     

鸭坦布苏病毒可视化RT-LAMP快速检测方法的建立与初步应用

为实现鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。