苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达

【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。     

苏云金芽胞杆菌BRC-HZP7杀虫晶体蛋白多样性分析

分离自武夷山土壤的苏云金芽胞杆菌BRC-HZP7菌株对小菜蛾和甜菜夜蛾幼虫有较好的毒杀作用.对该菌株进行了生理生化测定、cry基因的PCR-RFLP检测,以及通过SDS-PAGE检测晶体蛋白,并对蛋白点进行肽段指纹图谱鉴定.结果表明该菌株含有cry1Aa、cry1 Ba、cry1 Ia、cry2Ab、cry2Ac、cr...     

苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4杀虫晶体蛋白基因分析

利用稀释平板培养法从连云港地区的土壤中分离了一株苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4,通过PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE方法分析了此菌株中cry基因类型和表达蛋白。结果表明:该菌株中含有cry1Aa基因型,同时表达130~140kD的蛋白;但EcoRⅠ和PstⅠ酶切结果不同于正常的cry1Aa基因,实验中利用生物信息学方法设计的cry1Aa基因特异引物对扩增后也证明含有cry1Aa基因。室内生测结果显示,该菌株对重要的农业害虫甜菜夜蛾、菜青虫等均有较高的杀虫毒力。     

苏云金芽胞杆菌新菌株的研究

为筛选对昆虫有高力的苏云金芽胞杆菌特异性菌株,从韩国不同地区土壤中筛选出两株对鳞翅目和双翅目昆虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌菌株K9805和K9903,它们分属于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种和鲇泽亚种,形成典型的双金字塔型伴胞晶体,两菌株不但对小菜蛾、甜菜夜蛾具有较高的生命活性,而且对双翅目昆虫致倦库蚊有毒。K9805含有cry IAa,cy IAb,cry IC,cry ID和cry I基因,K9903含有cry IAa,cry IAb,cry IAc,cry IE和cry Ⅱ基因。     

源自动物粪便苏云金芽胞杆菌的cry基因型鉴定

从5种草食性哺乳动物的粪便中筛选获得8株苏云金芽胞杆菌(Bt);并用聚合酶链式反应—限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定体系鉴定各菌株的cry基因型.结果表明:BRC-WCB1、BRC-WCB2、BRC-WCB3、BRC-WCB8同时含有cry1和cry2基因;BRC-WCB6仅含有cry1I基因;BRC-WCB5含有cry3基因,但未出现预知的酶切条带;而BRC-WCB4无任何PCR扩增产物.     

产生伴胞晶体的芽胞杆菌CTC菌株的16S-23SrRNA间隔区分析

根据能形成伴胞晶体的特征，芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌幕虫亚种。但该菌株明显不同于典型的苏云金芽胞杆菌，因为其伴胞晶体蛋白并不是由杀虫晶体蛋白基因编码，而是编码细胞表面S-层蛋白基因的产物，且伴胞晶体蛋白没有检测到对昆虫的毒性。本研究基于对CTC菌株及参照菌的16S-23S rRNA间隔区、编码S-层蛋白的基因进行扩增并测序，从系统发育水平检测到CTC菌株明显与苏云金芽胞杆菌幕虫亚种典型菌株T02存在差异，表明芽胞杆菌CTC菌株更接近蜡状芽胞杆菌。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因的克隆及原核表达

[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因序列。[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Ac基因的重组质粒pUCLy1Ac。[结果]cry1Ac基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cry1Ac3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134 kD蛋白带。[结论]诱导表达的cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性。     

一株苏云金芽胞杆菌新菌株的基因型及其杀虫活性

苏云金芽胞杆菌Bt WL-1是本实验室自行分离得到的对鳞翅目多种害虫都具有较高活性的野生菌株。本研究利用扫描电镜观察发现,该菌株产生菱形伴孢晶体蛋白,该晶体蛋白对鳞翅目棉铃虫、二点委夜蛾、小菜蛾和小地老虎等2龄幼虫都具有较高的毒力。利用Bt基因通用引物PCR扩增得到该菌株含有cry1基因,8%SDS-PAGE检测得到该菌株只含有分子量为130kDa的蛋白主带。质谱分析表明,该蛋白主带和Bt Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ea、Cry1Ae、Cry1Db和Cry1Aa蛋白具有较高的同源性。     

苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达

采用5对引物组合经2轮PCR扩增对苏云金芽孢杆菌QL75-2菌株中的cry基因进行鉴定,克隆得到1个cry1Da型基因片段。通过设计全长引物扩增得到该cry基因的全长序列,转入原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,最后对表达蛋白进行生物活性分析。序列分析结果表明,该cry1Da基因全长3 495 bp,推测其编码1 164个氨基酸,组成分子量约132.01 ku的蛋白质。该预测蛋白质与已知的Cry1Da3蛋白质具有最高的序列同源性(99.7%),该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Da5。生物活性分析结果表明,Cry1Da5蛋白质对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性,其LC_(50)为21.47μg/mL,而对鳞翅目的棉铃虫幼虫无杀虫活性。因此,cry1Da5基因可作为一个新的cry基因资源在甜菜夜蛾的生物防治中应用。     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa 两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

苏云金杆菌新菌株WZ-7的PCR-RFLP分析及生物活性研究

利用PCR—RFLP技术分析了自河北省土壤中分离的苏云金杆菌新菌株WZ-7，结果表明该菌株含有cryl、cry2Ab、cryllal型基因，其中cryl型基因的酶切片段类型不同于已发表的基因类型，有可能含有新的基因。SDS—PAGE分析结果出现130、79、73、66、60、58kD左右的6种晶体蛋白，毒素蛋白类型属于Ⅱ型。室内生测结果显示，该菌株对重要的农业害虫棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾、菜青虫、玉米螟等均有较高的杀虫毒力。     

核型多角体病毒p74基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

 【目的】利用核型多角体病毒（NPV）的p74基因与苏云金芽胞杆菌（Bt）的cry1Ac基因构建融合基因cry1Ac-p74,构建具有广谱杀虫作用的工程菌。【方法】从Bt4.0718菌株中克隆cry1Ac基因及其终止子cry1Act,从苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）中克隆p74基因,以pMD-T作为大肠杆菌亚克隆载体,分别构建含有目的基因片段的T载体pT1Ac、pTp74、pT1Act以及中间载体pT1Act、pTp74Act,获得携带有目的融合基因cry1Ac-p74的表达载体pH1Acp74;该表达载体电转化至Bt无晶体突变株XBU001,得到目的重组菌株XBU-H1Acp74。【结果】XBU-H1Acp74可表达130 kD的Cry1Ac蛋白和50 kD的P74蛋白,生测显示P74蛋白可以协同Cry1Ac的杀虫效果。【结论】本研究成功构建了cry1Ac基因与p74基因融合的Bt工程菌,为进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株,研制出高效、广谱、安全的杀虫剂提供了新的技术途径。     

对甜菜夜蛾高毒力Bt新菌株的PCR-RFLP分析及生物活性测定

利用PCR-RFLP对Bt.新菌株cyz-13,T4-3的基因型进行分析。结果表明,cyz-13含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Bc,cry2Ab4种基因型,其中cyz-13菌株的PCR产物的酶切片断类型不同于已知的基因类型;T4-3菌株含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Ag,cry2Ac,cry1Ia5种基因型。室内生测结果显示,两菌株对甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫、玉米螟均具有高毒力,好于H D-1标准菌株。两菌株的发酵液均有杀虫活性,二者上清的杀虫因子不同。     

产Zwittermicin A的苏云金芽孢杆菌菌株的筛选及抗性基因zmaR的克隆与表达

 通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌，其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌（Erwinia herbicola）的抑菌活性，结果表明有67株菌有抑菌活性，其中21株抑菌活性较高。经鉴定，抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因，并从G03中克隆了zmaR全长基因，完成了序列测定。该基因编码区为1 125 bp，由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个，分子量为43.5 kD，等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21，可正常表达43.5 kD蛋白，并使宿主菌产生对Zwittermicin A的抗性。     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达(英文)

[目的]对 cry 基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据 NCBI 数据库信息设计引物序列,采用PCR 技术从抗虫棉基因组 DNA 中扩增出抗虫基因 cry 的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株中,利用 pGEX 原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同 IPTG 浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因 cry 的两段保守序列,长度分别为304 和 853 bp;SDSPAGE 检测结果显示,经 IPTG 诱导后重组质粒 pGEX4t1304 和 pGEX4t1853 成功地表达了大量 GST 融合蛋白,分子量分别为39 和 62.4 kDa,与预期结果一致;确定了 IPTG 最佳诱导浓度为 0.15 mmol/L,最佳诱导时间为 7 h。[结论]为今后检测转 Bt 基因农作物奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌CPB012菌株的杀虫功能基因鉴定及其对害虫的控制作用

【目的】分析并鉴定对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)具强致病性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CPB012菌株的杀虫基因型,为充分而有效地利用此生防菌奠定基础。【方法】CPB012菌株在LB培养基上30℃培养2-3 d,用苯酚品红进行晶体染色,观察伴孢晶体形态。cry1-cry10杀虫基因的检测选用技术成熟的PCR-RFLP（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism）法,即对某一类基因（如cry1、cry2…）保守区序列设计通用引物,并引入限制性内切酶识别序列,将扩增产物用相应的限制性内切酶处理,得到的酶切图谱可以初步判断杀虫基因多态性。同时结合特异性PCR方法对二、三级分类基因（如cry1A、cry2Aa…）设计特异性引物进行扩增,将扩增产物测序比对。cry11-cry40和vip基因通过设计引物进行PCR检测。菌株在LB培养基上培养24、48、72和96 h分别提取晶体蛋白,结合晶体蛋白的SDS-PAGE图谱分析其表达的杀虫蛋白。室内分别测定CPB012对鳞翅目家蚕(Bombyx mori)、鞘翅目马铃薯甲虫和双翅目橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)的杀虫效果;室内和田间测定CPB012与球孢白僵菌（Beauveria bassiana）MJ07菌株对马铃薯甲虫的生物协同防治效果。【结果】通过菌株形态和晶体形态的连续观察,发现CPB012能够产生方形和球形等晶体。基因型检测表明CPB012菌株含有cry1Aa、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab和vip3A,结合蛋白电泳图谱,其可能分别编码了约135、80、70、85-90 kD的大分子杀虫蛋白;同时可能还含有30和50 kD的两种新蛋白。室内生测试验显示,除马铃薯甲虫外,CPB012对家蚕和橘小实蝇也具有很强的毒杀作用,处理7 d 后死亡率分别为80.30%和76.72%。将CPB012与球孢白僵菌MJ07菌株按0.5﹕0.5剂量混合后室内接种,处理14 d后2龄马铃薯甲虫的累计死亡率达96.5%,极显著地(P<0.01)高于球孢白僵菌MJ07或苏云金芽孢杆菌CPB012单独处理的累计死亡率90.1%(MJ07)或83.3%（CPB012）。多重线性回归方程计算得出单独接种CPB012的LC₅₀为1.88×10⁷ cfu/mL,MJ07的LC₅₀为5.46×10⁷cfu/mL,而二者混用后LC₅₀为1.10×10⁷ cfu/mL,CTC（共毒系数）值为254,增效明显。在田间施用CPB012+MJ07混合剂(0.5﹕0.5)后对1龄和2龄马铃薯甲虫的防治效果分别为47.5%和43.8%, 显著高于MJ07、CPB012和Bt药剂对照的防治效果。【结论】苏云金芽孢杆菌CPB012的杀虫功能由cry1Aa、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab和vip3A等基因所决定,这些基因编码135、80、70、85-90 kD的杀虫毒蛋白。该菌的杀虫谱较广,对鞘翅目、鳞翅目和双翅目害虫都具有很强的生物毒性,其与球孢白僵菌MJ07混合施用可显著提高对马铃薯甲虫的防治效果。     

河北省不同生态区的苏云金芽孢杆菌cry基因多样性研究

为了明确苏云金芽孢杆菌在河北省不同生态区的分布特点和cry基因的多样性,研究从河北省不同生态地区(阜平天生桥、涞源白石山、安新白洋淀、保定郊区大田和安国中草药田)采集土样806份,采用温度-抗生素法分离获得Bt菌株46株,利用PCR-RFLP技术对46株Bt进行了基因型研究,结果表明从这些菌株中发现7种不同的基因型cry1、cry2、cry3、cry4、cry8、cry30和cry32,11株未鉴定出基因型;通过SDS-PAGE分析发现这些菌株主要表达130-150kDa、70-80kDa、60kDa和30kDa蛋白,实验结果说明了苏云金芽孢杆菌在河北省不同生态区均有分布,并且其cry基因类型是复杂多样的。