大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究

从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株.     

仔猪黄痢K88、K99基因工程菌、987P无毒菌三价苗的研制

仔猪黄痢主要危害1月龄以内的新生仔猪,尤其是1周龄内仔猪的发病率和死亡率最高,多以急性、水样腹泻为特征,预防仔猪黄痢最有效的措施是采用疫苗对怀孕母猪免疫接种,新生仔猪通过吮吸母猪初乳获得被动免疫。本疫苗是通过分别带有K88、K99、987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌,接种于适     

仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛疫苗的制备及小鼠免疫试验

为了更好地预防仔猪黄痢,选取野生分离菌株HN2001（K88ab）、HN2002（K88ac）、HN2003（K88ad）、HN2004（K99）、HN2005（987p）和HN2006（F41）培养后用低温磁力搅拌法提取菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗。试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95．0％,为进一步进行本体动物试验提供了有价值的参考资料。     

仔猪大肠埃希氏菌腹泻K88-LTB双价基因工程活疫苗-15℃保存期试验

本试验从本厂历年生产的仔猪大肠埃希氏菌腹泻K88-LTB双介基因工程活疫苗的产品留样中，随机抽取-15℃保存26-65个月的14批疫苗进行活菌计数，并对其中保存26-47个月的4批疫苗进行了特异性抗原检查、效力检验和安全性测定。结果表明，保存后的活菌数与原菌数相比没有明显降低，K88、LTB抗原检查均呈阳性，效力检验和安全性测定也达到《规程》规定的标准。     

间接ELISA检测禽流感抗体方法的建立

应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒 (AIV) ,经 triton X-1 0 0处理并反复冻融制备禽流感 EL ISA抗原。应用抗鸡 Ig轻链单抗 1 B7辣根过氧化物酶结合物建立了定量检测禽流感抗体水平的 EL ISA方法。确立了将鸡血清 1 0 0倍稀释监测 EL ISA效价(ET)的回归方程 y=0 .77452 x 0 .8793 5(r=0 .9466) ,可用于定量测定。血凝抑制 (HI)抗体与 EL ISA方法的比较试验表明 ,EL ISA法比血凝抑制试验敏感 1 .5倍以上     

新城疫病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组HN蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法.该方法检测AIV(H9亚型)、IBV、IBDV、EDSV 4种常见禽病病原的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12 800;批内重复性试验、批间重复性试验的变异系数分别小于5％和10％;与血凝抑制试验(HI)符合率为96.1％.本研究建立的NDV HN间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为NDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供一种技术手段.     

基于N蛋白的牛冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)抗体间接ELISA检测方法,对BCoV的N基因进行克隆,利用原核表达制备重组N蛋白,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,并对随机收集的奶牛血清样本进行检测.结果显示,重组N蛋白大小为50 ku,经Western blot鉴定重组N蛋白...     

ELISA检测IBV抗体方法的建立和标化

用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化传染性支气管炎病毒（IBV）作抗原，建立了检测IBV抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），特异性和重复性良好。已包放好抗原的ELISA板于—20℃保存5个月，不影响检验结果。     

生鲜牛乳中产肠毒素大肠埃希菌环介导等温扩增技术的建立与应用

为了快速检测生鲜牛乳中的产肠毒素大肠埃希菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC),防止食源性产肠毒素大肠埃希菌给人类造成的危害,建立快速检测不耐热型产肠毒素大肠埃希菌的环介导等温扩增方法(LAMP)。敏感性和特异性试验结果表明,该方法敏感性高,特异性强,能够从生鲜牛乳中检测到1pg产肠毒素大肠埃希菌DNA,与其他型大肠埃希菌及细菌不发生交叉反应。利用建立的LAMP技术对来自西宁市奶牛场及自由市场的21份生鲜牛乳样品进行检测,6份样品呈阳性,阳性检出率为28.6%,从分子水平为生鲜牛乳中产肠毒素大肠埃希菌的检测提供了一种快速、准确的手段,对保障生鲜牛乳的食品安全有重要意义。     

斑点酶联A蛋白免疫吸附试验(Dot-PPA-ELISA)检测猪衣原体抗体方法的建立

本研究建立了斑点酶联A蛋白免疫吸附试验（Dot-PPA-ELISA）,对猪衣原体IgG的最小检测量为1.21 ng。以间接血凝试验方法为对照,两种方法同时检测120头份猪血清样品,Dot-PPA-ELISA检出43头份（35.83%）,效价≥256;间接血凝试验检出26头份（21.67%）,效价≥64。诊断膜片与猪瘟、猪布氏杆菌病、猪口蹄疫和猪弓形体病标准阳性血清均不出现有意义的交叉反应。诊断膜片置室温、4℃和-20℃下至少保存3个月其抗原效价不变。试验表明本方法重复符合率为94.44%,且反应效果不受反应板质量和新旧的影响;试剂用量节省,各步骤均可做到严格定量,操作简便,3 h内可出结果,肉眼即可判断,不需要特殊检测仪器。由于辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白（PPA）是一种广谱诊断试剂,因此Dot-PPA-ELISA还可以用于其它哺乳动物衣原体抗体的检测。     

猪产肠毒素性大肠杆菌野生株K88菌毛蛋白结构基因的克隆与序列测定

根据报道的猪产肠毒素性大肠杆菌阳8茵毛结构基因DNA序列，在其保守区用Goldkey软件设计了1对引物，经PCR扩增从20株野生分离株质粒中得到17个大小在815bp左右的阳性产物，经纯化、连接、转化、筛选及核酸序列测定与分析，确认所克隆的外源基因与报道的K88菌毛(亚单位K88ab、K88ac、K88ad)蛋白结构基因序列一致，表明该菌毛蛋白结构基因的保守区间没有发生变异。     

适用于蛋鸡免疫的猪源ETEC菌毛蛋白佐剂的筛选

为筛选卵黄抗体的优良佐剂,以3株猪源致病性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白为模式抗原,分别与6种佐剂制备多价菌毛蛋白疫苗,免疫海兰褐壳蛋鸡。结果显示,3次免疫后,所有试验组蛋鸡产蛋率均有不同程度下降,但SPA、ISCOMs、弗氏佐剂、蜂胶佐剂组的产蛋率下降程度较为轻微;对鸡体血清抗体和制备获得的卵黄抗体的效价检测结果均显示:SPA和ISCOMs组虽较SPB、SPC、弗氏佐剂组抗体水平略低,但持久度较好,且通过对蛋鸡外观形态和注射部位组织变化情况的观察显示,两者不会刺激鸡体热反应或炎症反应,无任何表观副作用。因此,更适合作为蛋鸡制备猪源ETEC卵黄抗体的优良佐剂。     

产肠毒素性大肠杆菌K88与K99菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E.coli K88、K99基因序列,分别设计合成1对引物.利用PCR技术,以大肠杆菌C83907和C83644的质粒为模板分别扩增不含信号肽的K88及K99基因.通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切,连接和转化,构建了含K88-K99串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pETK88CK99).结果显示,经酶切,PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETK88CK99中含有K88K99融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量占菌体蛋白的40%左右,经Western blotting检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌K88、K99标准血清识别.结果表明,构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株.     

大肠杆菌K88纤毛抗原的提纯和抗血清的制备

以5％绵羊血改良Minca琼脂筛选和克隆表达良好的K88^＋菌株，改良Minca琼脂培养获得K88菌液。用加热法及高速匀浆法使K88纤毛从菌体上脱下。饱和硫酸铵沉淀粗提，用Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化K88抗原。提纯的抗原经SDS—PAGE电泳测定其分子量约为25000，且仅此一条蛋白带；与K88抗血清进行琼脂扩散试验只出现一条沉淀线。用提纯的抗原经多次免疫家兔制备了K88抗血清。抗血清在玻板凝集试验中只凝集K88菌株，不凝集K99，987P或F41菌株；在琼扩试验中，只与K88粗提抗原出现一条沉淀线，且效价为1：64，而不与K99，987P抗原出现沉淀线；在免疫电泳试验中，与无细胞K88纤毛液只出现一条沉淀线。鉴定结果表明，所制备的K88血清特异性强、效价高，可作为单因子血清用于凝集试验、琼扩试验等血清学试验，对K88菌株进行鉴定，对K88纤毛抗原进行定性和定量检测。     

共表达K88/987p菌毛产肠毒素性大肠杆菌的分离鉴定及其卵黄抗体的制备

为制备针对一些大型养猪场产肠毒素性大肠杆菌(enterotrxigenic Escherichia coli,ETEC)分离株的特异性卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin,IgY),试验对从这些养殖场分离的ETEC分离株菌毛基因类型进行了PCR鉴定,纯化该分离株的菌毛蛋白免疫蛋鸡制备IgY,对该IgY的效价、特异性和体外抑菌效果进行了检测。结果表明,该分离株具有K88和987p 两种菌毛基因,纯化后的分离株菌毛具有较强的免疫原性,经3次免疫后产生的IgY对K88和987p全菌和菌毛的效价可达到1:64 000,分离株菌毛IgY能特异地与K88和987p反应,与K99、F41无交叉反应,5 mg/mL分离株菌毛IgY在体外具有很好的抑菌效果。     

In vitro inhibition of ETEC K88 adhesion by pea hulls and of LT enterotoxin binding by faba bean hulls

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) expressing K88 (F4) adhesins are associated with post‐weaning diarrhoea in piglets. Different grain fractions from pea (Pisum sativum) and faba bean (Vicia faba) were tested in vitro for their capacity to counteract aetiological factors, which contribute to the development of diarrhoea. In detail, adhesion of E. coli O149:K91:K88ac (ETEC K88ac) to grain legume products, intended to impair the colonization of the host, was studied as well as interference with receptor binding of the pathogen’s heat‐labile enterotoxin LT, intended to reduce toxin‐inflicted gut cell damage. When comparing different pea and faba bean products tested for their binding capacity of ETEC K88ac, especially pea hulls, but also whole pea meal, starch‐enriched and protein‐enriched pea meal, and digestion‐resistant pea hull and meal fractions showed a higher binding of ETEC K88ac than faba bean products. In contrast to the ETEC K88ac adhesion results, bean hulls proved more effective than pea hulls in preventing GM1 receptor binding of LT. Previous small intestinal segment perfusion experiments we performed with ETEC K88ac‐challenged piglets indicated that both pea and bean hulls have the potential for successful application in diarrhoea prophylaxis and treatment, which is in agreement with and refined by our detection of their different modes of functioning.     

解淀粉芽孢杆菌SC06与肠毒性大肠杆菌K88对IPEC-1细胞转运载体、紧密连接、凋亡和免疫相关基因表达的影响

本试验以IPEC-1细胞为材料,探究解淀粉芽孢杆菌SC06(以下简称SC06)与肠毒性大肠杆菌K88(以下简称K88)对肠上皮屏障功能相关基因表达的影响。将IPEC-1细胞分为4个组并作不同处理:CK组为空白对照,不作处理; SC06组和SC06+K88组用含有108CFU/mL SC06的DM EM/F12培养基先预处理6 h,之后K88组和SC06+K88组加入含有108CFU/mL K88的DM EM/F12培养基处理3 h;乳酸脱氢酶(LDH)活性测定另设以含1%Trinton X-100的DM EM/F12培养基处理的Trinton组为阳性对照。各组细胞均培养9 h。结果表明:1)与CK组相比,K88和SC06单独处理均显著降低了葡萄糖转运载体2 (GLUT2)和小肽转运载体1(PepT1)基因的相对表达量(P<0.05),SC06单独处理显著增加了丙氨酸/丝氨酸/半胱氨酸/苏氨酸转运载体2(ASCT2)和兴奋性氨基酸转运载体1(EAAC1)基因的相对表达量(P<0.05);与K88单独处理相比,SC06预处理显著抑制了K88诱导的LDH活性和EAAC1基因相对表达量的增加(P<0.05)。2)与CK组相比,K88单独处理显著上调了闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)基因的表达(P <0.05),显著下调了密封蛋白(claudin)-3、claudin-4和黏蛋白-1(MUC1)基因的表达(P <0.05); SC06单独处理显著上调了ZO-1、claudin-4基因的表达(P <0.05); K88和SC06单独处理均显著促进了天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、凋亡相关因子(Fas)及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因的表达(P<0.05),显著抑制了天冬氨酸蛋白水解酶-9(caspase-9)与Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因的表达(P<0.05),且K88单独处理还显著降低了天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)基因的表达(P<0.05)。与K88单独处理相比,SC06预处理显著阻止了由K88诱导的ZO-1、caspase-3和Bcl-2基因相对表达量的增加(P<0.05)及claudin-3、claudin-4、MUC1、caspase-9和Bax基因相对表达量的降低(P <0.05)。3)与CK组相比,K88单独处理显著上调了肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)及转化生长因子β(TGF-β)基因的表达(P<0.05),并显著上调了核转录因子-κB-p50(NF-κB-p50)、肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)、髓样分化因子88(MyD88)、核苷酸结合寡聚域1(NOD-1)及Toll样受体-4(TLR4)基因的表达(P <0. 05); SC06单独处理显著降低了IL-6、NOD1与Toll样受体-6(TLR6)基因的表达(P<0.05),显著上调了TG F-β和MyD88基因的表达(P<0.05)。与K88单独处理相比,SC06预处理显著抑制了由K88导致的MyD88、NOD-1及TLR4基因相对表达量的增加(P<0.05)。综上所述,K88诱导IPEC-1细胞发生炎症反应,破坏肠上皮细胞的完整性,SC06在一定程度上有缓解作用。     

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314 bp;最终确定dNTP终浓度0.4 mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25 μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。     

牦牛致病性大肠埃希氏菌病的诊断

西藏那曲地区牦牛发病死亡数量较大，本病症状与大肠埃希氏菌病极为相似。通过对流行病学调查，临床症状及病理变化观察，细菌学、血清学检查鉴定，动物回归试验，首次证明引起那曲地区牦牛死亡的病因是由致病性大肠埃希氏菌所致。