山东东部地区规模化奶牛场引起奶牛呼吸道综合征的4种常见病毒血清学调查

为了解目前山东东部地区牛病毒性腹泻黏膜病病毒、传染性鼻气管炎病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3型这4种病原的感染情况,为疫病防控提供依据,从山东潍坊、烟台、青岛、威海等地区采集牛血清样品380份,采用ELISA方法进行了4种病毒的抗体检测。结果显示,BVDV抗体阳性率为62.11%;IBRV gB抗体阳性率最低为42.63%;BRSV抗体阳性率82.11%;BPIV3抗体阳性率81.05%,BRSV和BPIV3感染情况基本持平。被调查的14个牛场有12个牛场曾发生过4种病毒的感染,4种病毒均感染过的牛的比率在83.68%(318/380)。研究表明,山东东部地区多数规模化奶牛场存在这4种病毒的感染。     

1株B基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为探究新疆某集约化牛场1～6月龄犊牛群中牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染情况,对采集的60份犊牛鼻拭子样品进行RT-PCR检测、病毒分离鉴定及全基因组测序和遗传进化分析。结果显示,样品中BPIV3核酸阳性率为11.67%。从核酸阳性样品中分离获得1株BPIV3,并命名为XJ21032-1(45),其基因组全长为15 512 bp;遗传进化分析表明,XJ21032-1(45)属于BPIV3 B基因型,该分离株与澳大利亚的BPIV3 B基因型参考株Q5592(EU277658)的同源性最高为93.4%。本研究成功分离得到了1株B基因型BPIV3,证实B型毒株在我国的存在和流行,为BPIV3疫苗研发提供了原材料,也有助于我国BPIV3分子进化规律及溯源的进一步研究。     

牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下纯化后将其作为包被抗原,建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示作为包被抗原的重组N蛋白仅与BPIV3阳性牛血清发生特异性反应,与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒等牛的常见病原无血清学交叉反应,表明其特异性较强。牛BPIV3阳性血清在1:640倍稀释时按该方法检测仍为阳性,显示该方法具有较高的敏感性。重复性试验显示批内变异系数小于6%,批间变异系数小于12%,表明该方法具有较好的稳定性。对94份牛血清的比较试验显示,本研究建立的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。利用该方法检测了394份采自接种过BPIV3灭活苗牛场的血清样品和95份未接种疫苗牛场的血清样品,结果接种疫苗的牛血清均呈强阳性,而95份未接种疫苗牛血清的阳性率为80%。本研究建立的间接ELISA方法可以试用于国内BPIV3的流行病学调查和免疫监测,为国内BPIV3的防控提供技术支持。     

我国北方4省部分规模奶牛场牛呼吸道疾病综合征主要病原血清体检测

为了解我国牛呼吸道疾病综合征（BRDC）主要病原牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）与牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）的血清流行情况,使用抗体检测试剂盒,对4个省份的28家奶牛场采集的1 601份血清样品进行ELISA抗体检测。结果显示：奶牛IBRV、BVDV、BPIV3和BRSV抗体阳性率分别为76.2%、60.5%、63.2%和45.4%,奶牛场抗体阳性率分别为82.2%、75.0%、85.7%和89.3%。不同省份奶牛IBRV、BVDV、BPIV3和BRSV抗体阳性率分别为25.1%~90.3%、42.3%~81.3%、26.9%~81.1%和32.2%~51.9%,奶牛场抗体阳性率分别为20.0%~100%、57.2%~100%、75.0%~100%和75.0%~100%。奶牛IBRV、BVDV、BRSV抗体阳性检出率在3—5月最高,BPIV3抗体阳性检出率在12月到次年2月最高。奶牛场存在IBRV、BVDV、BPIV3和BRSV多种病原的混合感染,且各病原流行存在一定的地区和季节性差异。结果提示应加强对上述病原流行的控制,提高奶牛场管理水平。本研究为奶牛场呼吸道相关病毒病防控提供了数据参考。     

引起部分奶牛场呼吸道疾病的主要病毒性病原检测

近年来,我国部分地区奶牛场发生了以流黏性鼻液为主要症状的呼吸道疾病,经检测,排除牛支原体、牛巴氏杆菌感染。为探究其主要病毒性病原,从山东等4省(市)5家表现临床症状的奶牛场采集发病牛与无症状牛鼻拭子样品298份,开展牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)PCR检测。结果显示:发病奶牛场IBRV与BVDV阳性率分别为28.9%、7.1%,BPIV3未检出;发病牛与无症状牛IBRV阳性率分别为42.6%、10.9%,BVDV阳性率分别为11.3%、1.6%;IBRV、BVDV混合感染率为5.7%,IBRV、BVDV混合感染占IBRV总感染数的19.8%,占BVDV总感染数的81.0%。结果表明,引起这些奶牛场呼吸道症状的主要病原可能为IBRV、BVDV,且混合感染较严重。本研究为奶牛场呼吸道疾病防控提供了依据。     

2018年崇左市不同规模猪场伪狂犬病免疫及野毒感染的血清学调查

为了解广西崇左市伪狂犬病(PR)免疫情况和伪狂犬病毒(PRV)野毒感染及分布情况,于2018年从崇左市内53个不同规模的猪场共采集猪血清样品1 222份,通过ELISA方法检测伪狂犬病免疫抗体和野毒感染抗体。结果显示:崇左PRV gB蛋白免疫抗体阳性1 096份,阳性率为89.69%;PRV野毒感染抗体阳性200份,阳性率为16.37%;PRV野毒感染猪场阳性20个,猪场阳性率为37.74%(20/53)。按小、中、大规模猪场统计:gE蛋白抗体阳性率分别为27.39%(132/482)、11.48%(65/566)、1.72%(3/174);PRV gE蛋白抗体阳性猪场率分别为44.83%(13/29)、33.33%(6/18)、16.67%(1/6)。本次监测结果说明:崇左市规模猪场PRV免疫效果好,但部分规模猪场,特别是小规模猪场已经普遍存在PRV野毒感染。     

我国部分地区蛋鸡群鸭源鸡杆菌血清流行病学调查

为了解鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)在我国部分地区鸡群中的感染状况,本实验采用G.anatis微量凝集试验对我国河南、山东和山西等不同地区的1 314份鸡血清样品进行了G.anatis感染的血清流行病学调查,对G.anatis的感染率、感染品种、日龄等进行分析。结果表明:我国河南、山东和山西等地鸡群均存在G.anatis感染,其中G.anatis血清Ⅰ型抗体阳性率为11.95%,G.anatis血清Ⅱ型抗体阳性率为23.29%,G.anatis血清Ⅳ型抗体阳性率为9.82%。不同省份的鸡群感染G.anatis的血清阳性率存在一定差异,河南、山东和山西的血清阳性率分别为23.12%、25.27%和52.94%。对河南地区不同品种和日龄鸡的调查表明,均存在不同程度的感染,但血清阳性率有显著差异,表现为罗曼鸡的血清阳性率比海兰鸡高,开产前蛋鸡的血清阳性率低于开产后的血清阳性率。     

内蒙古地区部分奶牛场牛副流感血清学调查

为了解内蒙古地区奶牛场牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus 3,BPIV3）的感染状况,采用酶联免疫吸附法（ELISA）对6个奶牛场进行血清学调查。结果表明,该地区奶牛场中普遍存在BPIV3的感染情况,6个奶牛场均为阳性,阳性率最高达100%（15/15）,阳性率最低为90.90%（20/22）,平均阳性率为95.20%（119/125）。     

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。     

吉林地区部分规模化猪场猪圆环病毒流行情况调查

为了解猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)在吉林部分规模化猪场的流行情况,对吉林部分地区的10家规模化猪场的704份样品进行PCR检测,分析猪场PCV流行情况、感染季节及感染地区情况。结果表明,2017-2019年吉林地区部分规模化猪场PCV2的阳性率为42.0%(296/704),PCV3阳性率为34.2%(241/704),PCV2与PCV3混合感染率为22.7%(160/704);PCV2在仔猪中感染率较高,为49.7%(96/193),且秋季为PCV主要感染季节。研究结果表明,2017-2019年间吉林地区部分规模化猪场PCV感染普遍发生,且PCV2更易在仔猪群中流行。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征的调查与分析

运用RT PCR技术,对采自内蒙古、广州、广西、天津、北京、吉林和河北的疑似PRRS病料206份进行检测,其PRRSV阳性率在内蒙古为14.29%,广州为12.5%,广西为18.18%,天津为15%,北京为16.13%,吉林为13.6%,河北为22.58%,说明PRRS 在我国部分地区流行而且程度不同。进一步证明我国部分地区流行的PRRSV 为美洲型,但在序列上与美洲型有3个碱基差异。     

Establishment and Preliminary Application of Nano-PCR and LAMP Methods for Bovine Parainfluenza Type-3 Virus

This study was aimed to establish Nano-PCR and LAMP which were new rapid type of molecular detection technologies of bovine parainfluenza type-3 virus (BPIV3).The comparative specificity and sensitivity of BPIV3 Nano-PCR and LAMP PCR were tested, and the assay was applied to detect 10 clinical samples. The specificity and sensitivity tests showed that Nano-PCR and LAMP were only sensitive to BPIV3,without cross reaction to other viruses, such as bovine respiratory syncytial virus,infectious bovine rhinotracheitis virus and bovine viral diarrhea virus. In the sensitivity test, Nano-PCR and LAMP showed 10 times sensitivity than that of the traditional PCR technology,with the minimum detection of 4.16×10² copies/μL. Clinical test results showed that the coincidence rate of Nano-PCR and LAMP could reach to 100%, and the positive detection rate was much higher than that of normal PCR.Therefore, the Nano-PCR and LAMP methods established in this study provided a faster, sensitive and reliable tool for the clinical diagnosis of BPIV3.     

牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3 A型150 bp、B型253 bp和C型342 bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×10⁴、0.92×10⁴和1.53×10⁴拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。     

牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用

试验旨在建立牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza type-3 virus,BPIV3）纳米PCR（Nano-PCR）与环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）新型快速分子检测技术,对其进行特异性和敏感性对比试验,并对10份临床样品进行了检测。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR和LAMP方法只对BPIV3特异,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒无交叉反应;建立的Nano-PCR和LAMP方法具有相同的敏感性,均是普通PCR的10倍,最低核酸检出量均为4.16×10²拷贝/μL。临床检测结果显示,建立的两种方法阳性符合率为100%,且阳性检出率均高于普通PCR。因此,本试验建立的Nano-PCR和LAMP方法为BPIV3的临床诊断提供了更快速、敏感、可靠的工具。     

C基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定

为了对宁夏地区患有呼吸系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,试验主要利用RT-PCR方法对样品进行牛副流感3型病毒(BPIV3)M基因序列扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行亚克隆。通过氨苄青霉素平板筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定并利用分子生物学软件与GenBank上参考序列进行同源性比对。测序结果表明,从样品中分离到了1株BPIV3,并命名为NX49,其M基因全长为1056bp;进化分析表明,NX49隶属于BPIV3C基因型,其M基因与中国山东C型分离株SD0835具有较高同源性,核苷酸同源性为99.4%;理化分析表明,该毒株对温度、酸及有机物均敏感,高温孵育下Mg²⁺对该病毒无保护力;血凝试验表明,NX49对豚鼠红细胞凝集效价仅为1∶4,且仅在4℃孵育时出现凝集反应。本研究成功分离得到一株BPIV3C型毒株,这将有助于中国BPIV3分子进化规律及病毒流行特点的进一步研究。     

Isolation and Identification of BPIV3 Genotype C

To identify the infection agents from Ningxia Hui Autonomous region, where feedlot cattle indicated bovine respiratory disease complex (BRDC), the M gene of the bovine parainfluenza virus type 3 was amplified by RT-PCR.The PCR product was ligated to pMD18-T vector and cloned to E.coli DH5α.The positive clones were sequenced and compared with the reference strains in GenBank by the molecular biology software.Sequence alignment results showed that a BPIV3 strain was isolated from the samples and named NX49, the M gene of NX49 included 1 056 nucleotides.Evolutionary analysis showed that the NX49 belonged to BPIV3 C genotype and shared 99.4% nucleotide identity with that of the SD0835 isolated in Shandong province.The characterization of the NX49 demonstrated that it was sensitive to temperature, acid and organic matter.The presence of Mg²⁺ showed no protection against the treatment at high temperature.The HA test suggested that the NX49 enables to agglutinate the guinea pig RBC at 4 ℃ and the titer was 1∶4.The study isolated a BPIV3 genotype C strain successfully, which facilitate the study of molecular evolution and epidemiology of BPIV3 in China.     

部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

对黑龙江、吉林、辽宁、安徽、山东、内蒙、河南、河北、江苏、安徽、浙江、湖北、福建、广东、海南、上海等省、市猪群进行了猪流感的血清学和病原学调查研究。从 130 6份猪鼻棉拭子样品和死亡猪肺、气管样品中分离到 39株H3N2亚型猪流感病毒 ,12株 H1亚型猪流感病毒及其它亚型猪流感病毒 ,病毒粒子在透射电镜下呈现典型的正粘病毒特征 ,有囊膜和纤突 ,多为椭圆形、圆形、或杆形 ,直径约 80～ 12 0 nm。对 1997- 2 0 0 1年 3895份猪血清的血清学调查结果表明 ,近年中国多个地区猪群存在抗SWTN77(H1)、SWCO77(H3)、DKAT6 9(H1)、TKUK6 3(H3)流感病毒抗体 ;1998年来自河北的猪血清中抗 SWTN77阳性率高达 33.3% ;1999年来自内蒙的猪血清中抗 TKUK6 3和SWCO77阳性率分别为 13.3%和 2 6 .7% ;2 0 0 0- 2 0 0 1年调查的所有省市的猪群中均存在抗SWCO77抗体 ,阳性率从 3.2 %～ 10 0 %。说明近年我国猪群中 H3亚型猪流感的污染相当普遍     

牛副流感病毒3型毒株的分离鉴定及基因组遗传变异分析

从新疆地区某牛场出现发热、咳嗽等症状的多例病牛的肺组织中分离得到3株牛副流感病毒3型,分别命名为XJ03、XJ022、XJ023,对其中两株病毒XJ03和XJ023的基因组进行序列测定,测序结果显示,XJ03和XJ023毒株基因组全长分别为15474 bp(Gen Bank登录号为KU198929)和15475 bp,其核苷酸同源性为99.89%。同代表性的牛副流感病毒基因组比对发现,与我国的山东毒株SD0835同源性最高为99.3%,均属C型BPIV。在C型毒株中,与南韩12Q061分离株(C型)同源性最低为97.5%。F、N、HN、L、P、M蛋白基因氨基酸序列分析显示,与SD0835毒株相应序列对比,同源性分别为99.63%、92.15%、99.48%、99.28%、98.50%和100%,部分氨基酸发生了新的变异。试验结果将为今后更好地开展BPIV3防控奠定基础。