DKK2基因质粒的构建及其在敖汉细毛羊成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在探究DKK2基因过表达后在敖汉细毛羊成纤维细胞中的表达量变化.采集40日龄敖汉细毛羊胎羊皮肤组织作为实验样品,首先参照GenBank中绵羊的DKK2基因序列信息进行引物设计,通过PCR反应对DKK2基因进行扩增,并与pGM-T载体进行连接反应,构建了pGM-T-DKK2重组质粒;将克隆载体转化DH5α大肠杆菌...     

绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建及在其原代成纤维细胞中的瞬时表达

Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDNA终止密码子TGA删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经XhoⅠ/SacⅡ双酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染绵羊原代成纤维细胞,观测荧光表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆绵羊MSTN基因,通过PCR方法在MSTN阅读框两端引入了XhoⅠ和SacⅡ克隆位点,成功构建pAcGFP-MSTN融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染绵羊成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增出1138 bp的转录产物,并用Western blotting检测到78 ku目的蛋白的表达。本试验为研究MSTN基因在成纤维细胞和脂肪分化调控中的具体机制奠定基础。     

牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染.克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体.用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24 h后观察荧光表达,48 h后加入600μg·mL-1 G418,筛选1周,300 p.g·mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养.对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析.结果,转染24 h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEGFP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1500 bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体.说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性.可以作为核移植进行转基因克隆牛研究.     

新疆细毛羊pEGFP-C2-KAP6.1真核表达质粒的构建与鉴定

试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。     

猪圆环病毒2型orf2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达与生物活性鉴定

为获得稳定表达猪圆环病毒2型(PCV-2)orf2基因的奶山羊胎儿成纤维细胞,将PCV-2 orf2基因与筛选基因neo表达框串联插入到pBC1质粒,得到重组的真核表达载体pBC1-orf2-neo。然后采用脂质体介导法将重组质粒转染至奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),经G418筛选获得具有稳定抗性的阳性gFFs细胞株。RT-PCR分析显示,在获得的阳性gFFs细胞株中能够扩增出689bp的orf2基因和1 953bp的neo表达框,与预期结果相符。Western blot分析显示,获得了约37 000的表达产物,且能够与兔抗PCV-2Cap蛋白抗体发生反应。结果表明,orf2基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞染色体上并能够正确表达,表达产物具有良好的反应原性,这为构建分泌Cap蛋白的奶山羊乳腺生物反应器奠定了理论和物质基础。     

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

新疆细毛羊eIF3l基因的克隆、原核表达及蛋白检测

为了探究新疆细毛羊真核生物翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factors,eIFs)基因eIF3l序列和原核表达蛋白特征,采用RTPCR法从新疆细毛羊成纤维细胞中克隆eIF3l基因mRNA的CDS区编码序列,构建其原核表达载体,并进行原核表达和蛋白检测。结果显示:完整获得eIF3l基因1 695 bp,共编码564个氨基酸残基;37℃,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3.5 h可形成大量包涵体蛋白,其分子量约为69 ku;Western blot鉴定目的蛋白表达正确。结果表明:新疆细毛羊eIF3l基因原核表达成功,为进一步研究其功能和应用提供了科学数据。     

崂山奶山羊Myostatin基因真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的表达研究

试验克隆了崂山奶山羊Myostatin基因序列,构建了其真核表达载体,并验证了其在成纤维细胞中的表达。本研究通过从崂山奶山羊肌肉组织中提取RNA,反转录后采用巢式PCR方法扩增出Myostatin基因序列,构建真核表达载体,通过转染成纤维细胞,采用RT-PCR方法验证其表达。结果表明,克隆出崂山奶山羊Myostatin基因的全长cDNA序列,大小为1128 bp,GenBank登录号:GU377303.1;构建pcDNA-MSTN真核表达载体,转染成纤维细胞48 h后通过RT-PCR检测,结果显示,Myostatin表达量显著增加,表明成功构建pcDNA-MSTN真核表达载体,为进一步研究Myostatin的生物学功能及转基因羊培育奠定基础。     

FecB基因对杜泊羊和湖羊杂交后代产羔率与生长性能的影响

为研究FecB基因在杜泊羊和湖羊杂交后代种群中的多态性及遗传规律,试验以白头杜泊羊为父本,湖羊和杜湖杂交母羊为母本在饲养条件相同的舍饲条件下进行杂交,统计母羊产羔率,测定羔羊初生至6月龄的生长发育数据,并应用PCR-RFLP方法对杂交后代羔羊的FecB基因进行检测,分析其基因型.结果表明:FecB基因有BB、B+和++...     

多胎基因FecB对德×寒×细三元杂交羊产羔性能的影响

为了研究FecB基因在德×寒×细三元杂交羊群体中的多态性分布及与产羔性能指标的相关性,该试验将以德国肉用美利奴羊（以下简称德肉美）为父本,以小尾寒羊公羊与东北细毛羊母羊级进杂交生产的F₂代羊为母本（以下简称寒×细F₂母羊）,生产的三元杂交后代羊（以下简称德×寒×细三元杂交羊）作为研究对象,采用KASP方法分析FecB基因型并计算基因频率和基因型频率,分析FecB基因频率与德×寒×细三元杂交羊群体产羔性能的相关性。结果发现,德肉美并不含有FecB基因,德×寒×细三元杂交羊B等位基因频率增加明显且处于Hardy-weinberg不平衡状态,提示人工选择对杂交羊群体FecB基因富集影响较大。对寒×细F₂代母羊和德×寒×细三元杂交羊群体不同基因型个体产羔数进行秩和检验分析发现,P值均小于0.01,平均产羔率均表现为++基因型小于B+和BB基因型（P<0.05）,说明B等位基因对德×寒×细三元杂交羊群体产羔性能的提升发挥重要作用。该试验为利用FecB基因提升德×寒×细三元杂交羊群体产羔性能提供参考。     

FecB基因在5个中国地方绵羊品种中的多态性及其与产羔数的关联分析

为解析中国地方绵羊品种产羔数差异形成的遗传学机制,以5个不同繁殖力的中国地方绵羊品种(湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊和多浪羊)为研究对象,利用PCR-RFLP技术检测FecB基因的多态性,比较不同繁殖力群体间FecB的分布情况,并与其产羔数进行关联分析。结果显示:湖羊群体中存在BB、B+、++三种基因型,藏羊、蒙古羊及阿勒泰羊群体中仅存在B+和++两种基因型,多浪羊群体中仅存在++基因型。湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊及多浪羊群体中BB、B+及++基因型频率依次是0.69、0.28、0.03,0.00、0.13、0.88,0.00、0.08、0.92,0.00、0.08、0.92和0.00、0.00、1.00;B等位基因频率由高到低依次为湖羊>藏羊>蒙古羊=阿勒泰羊>多浪羊。湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊中该位点He和PIC分别为0.29、0.25,0.12、0.11,0.08、0.07和0.08、0.07,且在以上4个品种中BB和B+基因型个体产羔数比++基因型个体高(P<0.01),BB基因型个体和B+基因型个体之间无差异(P>0.05)。由此可推断,FecB或许是决定绵羊产羔数的主效基因,亦或是与其存在密切相关的标记基因,可助力绵羊产羔数性状MAS技术和为多胎绵羊新品种(系)培育提供素材。     

黄淮杜泊羊繁殖性能和FecB基因多态性研究

为系统评价黄淮杜泊羊的繁殖性能,本实验对2家黄淮杜泊羊核心育种场1年的繁殖数据进行了统计和分析,并随机采集了145只核心群羊只进行FecB基因多态性分析。结果表明:黄淮杜泊羊性成熟为6～7月龄,年繁殖率为252.82%,羔羊断奶成活率为95.79%,每只母羊年提供断奶羔羊数2.39个;黄淮杜泊羊群体FecB基因存在BB、B+和++3种基因型,其中B+型(杂合型)是群体中的优势基因型,基因型频率为0.606 9;基因型与产羔数关联分析表明,BB和B+基因型产羔数极显著高于++基因型。综上,黄淮杜泊羊具有多胎高繁的特性,在繁殖性能方面符合专门化肉用高繁绵羊品种的标准。     

BAD基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢表达规律及对生殖激素的影响

本实验研究旨在探究BAD基因在敖汉细毛羊中的不同发情时期卵巢中表达量的变化规律以及对生殖激素的影响,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。首先利用放射免疫方法测定敖汉细毛羊血液中促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_2)和孕激素(P_4)的浓度,然后利用qRT-PCR检测乏情期、发情前期、发情间期和发情期卵巢BAD基因的表达量变化。结果表明:卵巢中BAD基因在发情前期的表达量极显著高于乏情期、发情期和发情间期(P0.01),在发情期的表达量极显著高于乏情期和发情间期(P0.01),乏情期和发情间期的表达量基本相同(P0.05);E_2和LH浓度在BAD基因表达量最高的发情前期维持较高水平,P_4的浓度维持较低水平。综上可知,BAD基因的表达可能促进了E_2和LH浓度升高,抑制了P_4产生,进而影响细毛羊发情,可为绵羊发情的研究提供借鉴。     

FecB基因对绵羊生产性能影响的研究进展

FecB基因是发现最早的具有促进排卵的多胎基因,自从在澳大利亚布鲁拉美利奴羊(Booroola Merino)上发现该基因以来,人们利用Booroola Merino开展了大量杂交试验,并在各国绵羊品种中相继开展了寻找FecB基因的工作,在基因多态性与母羊繁殖性状关联分析方面做了大量研究。文章从FecB基因的品种分布及对繁殖性能(排卵数、产羔数、繁殖规律)、肉用性能(生长发育、肉品质)和产毛、产奶等生产性能方面的影响进行了系统总结,并对该基因的利用提出了建议和展望。     

两种绵羊杂种 GDF9 基因和 FecB 基因的多态性及其与产羔数和体重关系的研究

以绵羊GDF9和FecB基因为候选基因,分别应用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法研究了德滩寒杂种羊和陶滩寒杂种羊共63只个体的基因多态性以及基因多态性对产羔数和体重的影响。结果表明,两种基因在两种杂交绵羊群体中各有2种基因型(AA和AB,CC和CD)。在德滩寒杂种羊群体中基因型频率分别为0.09(AA)、0.91(AB)、0.53(CC)、0.47(CD);陶滩寒杂种羊群体中基因型频率分别为0.19(AA)、0.81(AB)、0.58(CC)、0.42(CD)。对德滩寒杂种羊群体研究发现:AA基因型群体平均产羔数为2.50,显著高于AB基因型群体(1.63,P<0.05);CD基因型群体平均产羔数为2.33,显著高于CC基因型群体(1.50,P<0.05)。对陶滩寒杂种羊群体研究发现:AA基因型群体平均产羔数为2.67,显著高于AB基因型群体(1.96,P<0.05);CD基因型群体与CC基因型群体平均产羔数相差不大。这些结果表明:GDF9基因的杂合子与两种杂种绵羊的产羔数之间呈显著负相关;FecB基因杂合子与陶滩寒杂种羊产羔数之间呈显著正相关。FecB基因和GDF9基因对两种绵羊杂种的初生重和断奶重无显著影响。