蒲公英内生真菌PG2分子鉴定及抑菌物质的研究

药用植物内生真菌是新型抗菌药物的微生物来源。试验以清热解毒类中草药蒲公英中分离的高抑菌活性的内生真菌PG2为研究对象,通过ITS序列分析确定其种属地位;对其发酵液中高效抑菌活性物质的类别、热稳定性及抑菌物质的极性进行了初步研究,并对高抑菌活性的物质通过柱层析分离,以红外光谱分析其结构。结果表明:PG2经分子生物学鉴定为半知菌门、丛梗孢科、尾孢霉属;活性物质为多糖类物质,具有一定的热稳定性。抑菌活性物质主要分布于乙酸乙酯和正丁醇的萃取相中。通过对正丁醇萃取相的抑菌活性物质硅胶柱层析,分离出活性成分SP1,经红外光谱法测定其含有羰基、羟基等官能团结构。结论:PG2为产高效抑菌物质的内生真菌,分离出的活性物质SP1为含有羰基、羟基等官能团的多糖类物质。     

响应面分析法优化蒲公英内生真菌培养基条件的研究

本研究对具有抗菌特性的蒲公英中内生真菌产抑菌物质的最适培养基进行优化。在摇瓶发酵条件下,以金黄色葡萄球菌为指示菌,先确定碳源、氮源、蒲公英汁单因素成分及最佳水平,再采用Box-Behnken和响应面分析法对培养基配方进行优化,确定最适培养基组成为:碳源(葡萄糖2.65%+豆油0.53%)、氮源(玉米粉0.10%)、蒲公英汁7.06%。蒲公英内生真菌抑金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到了40.0mm,是优化前的2.43倍。     

药用植物柽柳内生真菌分离及其抑菌活性初步研究

为探明药用植物柽柳内生真菌资源的多样性及其抑菌活性特征,通过组织块法对内生真菌进行了分离,并选择小麦全蚀病菌、枸杞黑果病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定其抑菌活性。结果显示,从柽柳不同组织器官中分离出18株内生真菌,茎部最多,根部次之,叶部最少;经形态学初步分类鉴定归于2个目,3个科,7个属;有11株菌对2种或多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用,占菌株总数的61.1%,有8株内生真菌只对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用,占分离菌株总数的44.4%;活性内生真菌菌株TCEFL001分别对枸杞黑果病菌、小麦全蚀病菌以及金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用,属于组丝核菌属。药用植物柽柳具有较为丰富的内生真菌资源,其开发和利用值得进一步探究。     

罗汉松内生真菌的抑菌活性研究

为了研究药用植物内生真菌的次生代谢产物是否具有抑菌活性,以96株罗汉松内生真菌为研究材料,将菌丝及其培养液经氯仿-甲醇抽提后,采用杯碟法测定了全部菌株的抑菌活性。罗汉松内生真菌中49%的菌株具有抑菌作用,其中菌株LHS18、LHS42、LHS67、LHS92和LHS93抽提物经100倍稀释后对金黄色葡萄球菌仍有强的抑菌作用,菌株LHS30抽提物的100倍稀释溶液对大肠杆菌的生长有强烈的抑制作用。对抑菌活性较强的6株菌根据其ITS序列相似性进行了分子鉴定。菌株LHS18和LHS42鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）,LHS92为四孢脉孢菌（Neurospora tetrasperma）,LHS30为丝枝霉（Aphanocladium sp.）,LHS67为拟茎点霉（Phomopsis liquidambari）,LHS93未能鉴定出种属。研究结果提示,罗汉松内生真菌中49%菌株具有抑菌活性,其中6株菌对动物和人类的病原菌有强列的抑制作用,是挖掘高效抑菌物质的重要资源。     

线叶嵩草内生真菌抗植物病原真菌活性测定

从线叶嵩草Kobresia capillifolia中分离得到7株内生真菌,经过形态学方法鉴定有3株属于镰孢属Fusarium sp.,1株属于枝顶孢属Acremonium sp.,1株属于黑团孢霉属Periconia sp.,另外有2株未产孢,不能用形态学方法鉴定。测定这7株内生真菌在不同温度下的生长速度,并以棉花立枯丝核菌Rhizoctonia solani（简称R 1）、小麦根腐离孺孢Bipolaris sorokiniana（简称B 1）、终极腐霉Pythium ultimum（简称P 1）和黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum（简称F 1)作为试验菌进行了抑菌活性测定。结果表明,供试的内生真菌有71.43%表现出良好的喜低温生长的特性;7株菌株中有4株对小麦根腐离孺孢的抑制作用较强,菌株SY3的抑制作用最强,抑菌率达到了61.84%,抑菌区也在10 mm以上;有4株对棉花立枯丝核菌有抑制作用,但抑制作用较弱,抑菌区亦不明显;对黄瓜枯萎病菌的抑制作用都较弱,抑菌区不明显;仅有1株对终极腐霉有较强抑制作用,抑菌率为13.75%,抑菌区也达到了5～10 mm。     

甘草内生真菌分离及其抑菌活性初探

为了解药用植物甘草(Glycyrrhiza uralensis)内生真菌资源多样性及其抑菌活性特征,通过组织块法对内生真菌进行分离,并选择小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var.tritici）、枸杞黑果病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.cucumeris）、黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）4种细菌作为供试指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。试验结果显示,从甘草根、茎、叶中分离出20株内生真菌,其中根部最多,占分离菌株总数的65.0%,其次为茎部,叶部最少;经形态学初步分类鉴定归于2目2科5属,梭孢霉属为优势菌属,占分离菌株总数的70.0%;在分离的内生真菌中有15株菌对1种或1种以上供试植物病原真菌有不同程度的抑制作用,为分离内生真菌总数的75.0%,19株菌对1种或1种以上供试细菌有不同程度的抑制作用,为分离内生真菌总数的95.0%;有7株内生真菌对枯草芽孢杆菌拮抗活性差异显著（P＜0.05）,有 8株内生真菌对金黄色葡萄球菌拮抗活性差异显著,有3株内生真菌对大肠杆菌拮抗活性差异显著,有1株内生真菌对革兰氏阴性铜绿假单胞菌拮抗活性差异显著,其中菌株RLEFR015对番茄灰霉病菌、金黄色葡萄球菌拮抗活性差异显著,菌株RLEFR010对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌拮抗活性差异显著,菌株RLEFR002对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌供试细菌拮抗活性差异显著;菌株RLEFR015、RLEFR002、RLEFR010均为梭孢霉属,为高活性菌株。甘草内生真菌具有多样性和抑菌活性,多数菌株对供试病原真菌和病原细菌具有拮抗活性,对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌拮抗活性较强,预示着甘草内生真菌具有重要的资源价值。     

植物内生真菌的应用研究概况

近年来,植物内生真菌的研究应用已成为一大热点。植物内生真菌及其次生代谢产物能产生抗癌物质,促进植物生长,增强宿主植物的竞争力和抗逆性等,在医药、植物生长促进剂、生物农药、育种等领域应用前景广阔。就植物内生真菌及次生代谢产物的研究情况进行系统的阐述,并就其开发应用前景作以综合的介绍。     

禾本科牧草内生真菌的研究与应用

内生真菌广泛分布在禾本科植物体内,通常与寄主植物形成互利共生的关系。本研究就禾本科牧草内生真菌的分布及传播特点,增强寄主植物的抗虫性、抗病性和抗旱性,促进寄主植物生长并提高其竞争能力,以及对家畜的危害和如何有效利用等问题进行综述。     

高羊茅种子内生真菌的检测研究

对中国农科院畜牧所、四川长江草业研究中心、中农草业有限公司提供的7个高羊茅品种进行种子带菌的检验。结果表明,高羊茅品种2、坦波、法尔肯、猎狗5号带菌,带菌率依次为73%、56%、50%、80%。     

小花棘豆产苦马豆素内生真菌的筛选与鉴定

通过对小花棘豆内生真菌的分离纯化,筛选产苦马豆素内生真菌,探讨小花棘豆内生真菌与其毒性成分苦马豆素的相互关系。本研究对采自内蒙古西部草地的6份小花棘豆样品进行内生真菌分离纯化,采用薄层色谱和气相色谱技术对内生真菌发酵液进行苦马豆素定性、定量检测,筛选产苦马豆素内生真菌;结合形态学和分子生物学方法进行内生真菌种属鉴定。从小花棘豆样品中分离得到6株内生真菌。经筛选,其中有2株产苦马豆素,编号为XJ-J-I和XJ-H-1,其发酵液中苦马豆素产量分别为4.209 2mg.L-1和16.733 8mg.L-1。鉴定结果表明,这2株内生真菌虽然形态学存在差异,但基因型相同,同属镰刀属内生真菌—层出镰刀菌(Fusarium prolifera-tum)。小花棘豆中存在产苦马豆素内生真菌。     

内蒙古不同小花棘豆种群苦马豆素及其内生真菌关系的分析

小花棘豆是广泛分布于内蒙古草原和荒漠区的一种有毒植物,其主要毒性成分为有毒生物碱——苦马豆素（swainsonine,SW）,牲畜采食后可引起中毒,甚至死亡,给当地畜牧业造成重大经济损失。本研究旨在探究内蒙古不同小花棘豆种群植株苦马豆素及其与内生真菌关系。采集内蒙古8个样地120株小花棘豆,利用萃取、离心、离子交换层析法提取和纯化植物单株和菌丝体的SW,用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）检测SW水平,取茎和叶外植体分离培养内生真菌,提取植物和真菌的总DNA,扩增真菌特异序列,利用内生真菌微生物学特征和DNA序列比对进行鉴定。结果显示：8个种群共111株小花棘豆检测出SW,最高水平为369.05 μg·g^-1,平均水平32.78 μg·g^-1,从38株小花棘豆分离培养出内生真菌,纯培养下菌丝体呈松散白色绒毛状,菌落圆形、隆起、边缘整齐、辐射状生长,颜色逐渐呈现灰色、深灰色或褐色至深褐色,内生真菌均测出SW,其水平为0.83~2 573.24 μg·g^-1,经微生物学研究及5.8S rDNA/ITS序列比对分析,在属水平上鉴定该内生真菌为Alternaria。有Alternaria内生真菌的小花棘豆植株含SW,无该内生真菌的植株不含SW,培养的Alternaria内生真菌合成了SW。     

中国主要疯草内生真菌分离鉴定及其抑菌活性研究

探明中国西部草地主要疯草内生真菌的种类及其分布,并通过内生真菌次生代谢产物抑菌活性筛选,为疯草内生真菌次生代谢产物开发利用提供参考。将采自青海和内蒙古草地的小花棘豆、黄花棘豆、甘肃棘豆、急弯棘豆、兰花棘豆和变异黄芪,运用表面消毒法进行内生真菌分离纯化;采用形态学和结合rDNA-ITS序列分析技术种属鉴定,NJ法构建系统发育树并分析其亲缘关系;以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和沙门菌为测试菌株,用纸片法进行抑菌活性筛选。结果从中国6种主要疯草中分离获得265株内生真菌,合并得到38株,30株分属12科19属,8株未确定科。其中镰刀菌属、链格孢属和拟青霉属是优势种群,分别占总菌株的16.98%、11.32%和9.81%;系统发育分析显示,38株内生真菌绝大部分具有较高亲缘关系,仅少数亲缘关系偏低,其亲缘关系的远近受疯草种类、部位及生态环境等多种因素的影响;抑菌试验结果表明,38株内生真菌有29株次生代谢产物至少对1种测试病原菌有抑菌活性,占总分离菌株的76.32%,其中有2株次生代谢产物对4种测试病原菌均有较强抑菌作用。中国西部草地疯草含有丰富的内生真菌,不同生态地域的疯草内生真菌分布存在空间差异性,其次生代谢产物中存在丰富的天然抑菌活性物质,可作为筛选抑菌活性物质的新资源。     

青藏高原不同海拔梯度黄花棘豆内生真菌多样性研究

为了分析不同海拔梯度黄花棘豆（Oxytropis ochrocephala）内生真菌的多样性及群落结构,进而为调控其主要成分-苦马豆素产量提供新的途径。本试验采用高通量测序技术测定青藏高原不同海拔梯度（2 512,3 005,3 490,3 977和4 493 m）黄花棘豆中内生真菌的ITS序列,观测真菌多样性和群落组成随海拔升高的变化情况,并运用CANOCO 5.0软件对真菌优势群落与植物营养和土壤环境因子间的关系进行冗余分析（Redundancy analysis,RDA）。结果表明：不同海拔梯度植物营养成分及土壤理化性质间均差异显著;从5个海拔梯度的黄花棘豆的样本中获得3615854条ITS序列,在97%序列相似性基础上可划分为750个分类单位（Operational Taxonomic Units,OTUs）。真菌群落的丰富度（Chao1）指数以海拔4 493 m最高,为254.10,而多样性（Shannon）指数以海拔3 005 m最高,为3.05。子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是青藏高原黄花棘豆内生真菌的优势类群。RDA分析结果显示,真菌优势类群与海拔、粗灰分和土壤有机碳呈极显著相关（P<0.01）,与氮、磷和无氮浸出物呈显著相关（P<0.05）。海拔、植物营养及土壤养分含量均会影响黄花棘豆内生真菌多样性。     

红树内生菌代谢产物抑菌作用的初步观察

观察红树内生菌CⅢ-1代谢产物对金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大肠杆菌以及沙门氏菌等常见动物病原菌的抑菌效果。结果表明,CⅢ-1代谢产物对金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌有较强的抑制作用,且抑菌活性随代谢产物浓度的增加而增加;金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌和埃希氏大肠杆菌对8倍浓缩的CⅢ-1代谢产物高度敏感,但沙门氏菌呈中度敏感。CⅢ-1浓缩样品与几种常用抗生素的抑菌效果相当。     

桑树内生枯草芽孢杆菌TasA基因的克隆及序列分析与表达产物的抑菌作用

TasA是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢的形成过程中产生的蛋白,对多种动、植物病原菌有较强的抑制作用。从桑树内生枯草芽孢杆菌菌株ME0717基因组DNA中克隆到TasA基因的全序列,包含一个786bp的完整开放阅读框(ORF),GenBank登录号为FJ713582。该序列与来源于B.subtilis的已知同源TasA序列Z99116、AJ871386的相似性达99.0%和98.1%,与芽孢形成相关的基因YqhF(GenBank登录号:BACJH642)的序列相似性也达99.0%,而与来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的TasA序列(GenBank登录号:AE017333)相似性仅有46.0%,与来源于其它芽孢杆菌属的金属蛋白酶基因和芽孢外壳相关蛋白基因也有较高的相似性。构建该基因的原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中获得表达,表达产物对桑疫病病原细菌的菌体生长以及桑漆斑病菌和桑炭疽病菌的菌丝生长均有一定程度的抑制作用。     

泰妙菌素对人CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6酶活性的影响

本研究通过建立人肝微粒体体外孵育试验,考察泰妙菌素对4种CYP450亚酶的探针底物睾酮、非那西丁、氯唑沙宗、氢溴酸右美沙芬代谢的影响,以反映泰妙菌素对人CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6酶活性的作用。试验分为3组：药物试验组、阳性对照组（不含NADPH）、阴性对照组（不含CYP450抑制剂）,孵育体系为100 μL,孵育试验在96孔板中进行。终止反应后使用高效液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）,以内标法检测96孔板中孵育液的剩余探针底物浓度。根据药物试验组与阴性对照组的探针药物代谢浓度之比,计算药物试验组的探针药物代谢率。使用Graphpad Prism 6.0软件,以药物试验组相对代谢率为纵坐标,药物浓度对数值为横坐标作图,计算试验组药物IC₅₀值。针对泰妙菌素与CYP3A4的孵育试验设置多个孵育时间点观察孵育时间对IC₅₀值的影响。试验结果显示,酮康唑对CYP3A4的IC₅₀值为0.044 μmol/L,α-萘黄酮对CYP1A2的IC₅₀值为0.030 μmol/L、4-甲基吡唑对CYP2E1的IC₅₀值为0.022 μmol/L、奎尼丁对CYP2D6的IC₅₀值为0.096 μmol/L。泰妙菌素对CYP1A2及CYP2D6的IC₅₀值均大于50 μmol/L,对CYP2E1的IC₅₀值为0.045 μmol/L,对CYP3A4的IC₅₀值为1.609 μmol/L。延长泰妙菌素与CYP3A4的孵育时间（10~50 min）后,泰妙菌素对CYP3A4的IC₅₀值由1.609 μmol/L增加至 8.657 μmol/L。本研究中4种亚酶常用抑制剂的IC₅₀值与参照值相近,表明所建立人肝微粒体体外孵育试验方法可靠。以IC₅₀值为指标显示泰妙菌素对CYP1A2和CYP2D6无抑制作用,对CYP2E1和CYP3A4存在强抑制作用,泰妙菌素可能是CYP3A4的可逆性抑制剂。     

鹿茸蛋白的提取分离及其抗肿瘤活性

鹿茸粉脱脂后,用ＮａＣｌ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ６）提取,应用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０层析柱分离纯化后,获得鹿茸蛋白。给腹腔接种Ｓ１８０型小鼠口服鹿茸蛋白提取物,观察生存时间,结果表明,口服鹿茸蛋白的试验组与对照组生存时间相比,差异显著（Ｐ＜００５）。     

miR-14对麦冬多糖脂质体调节枯否氏细胞免疫活性的影响

以枯否氏细胞(KCs)为细胞模型,研究miR-14对麦冬多糖脂质体(OPL)调节免疫活性的影响.首先转染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor,再用OPL处理,然后采用Griess、流式细胞术、荧光染色以及细胞划痕等方法检测NO和iNOS的分泌、吞噬FITC-dextran和FITC-OVA的活性、...