蚕抗菌肽的诱导及功能的研究

一、昆虫抗菌肽的诱导 1974年,瑞典Boman等首先发现将大肠杆菌注射于惜古比天蚕蛹,能诱导血淋巴产生具有广谱杀菌作用的抗菌肽。1981年,黄自然等报道注射大肠杆菌于滞育柞蚕蛹,诱导产生溶菌酶及抗菌肽。1982年,屈贤铭等分离了柞蚕抗菌肽的多个成员并分析了抗菌肽B及D的一级结构。同年,祁国荣等首次     

不同品种家蚕滞育蛹抗菌活性物质的抗菌性能研究

对家蚕滞育蛹抗菌活性物质的性质进行研究,并对不同家蚕品种滞育蛹之间的抗菌肽的性能进行比较。结果表明:家蚕滞育蛹血淋巴抗菌活性物质具有较强的热稳定性和较好的耐酸性。诱导雄蛹产生的抗菌活性物质的抗菌活性要高于雌蛹,家蚕滞育蛹对柞蚕链球菌(1212)的抵御性较其他诱导源强,不同品种家蚕滞育蛹诱导后产生的抗菌活性物质的抑菌活性可能与其品种的特有属性有关。     

柞蚕抗病机制及抗病物质的研究——Ⅰ.柞蚕肠道致病菌等诱导柞蚕蛹产生抗菌物质的比较研究

本文报道了柞蚕肠道致病菌、灭活的柞蚕病毒和微粒子孢子以及柞蚕自身物质诱导柞蚕蛹产生抗菌物质的试验.并与大肠杆菌(Escherichia coli K-12D31)的诱导活性进行了比较;应用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述诱导源诱导产生的抗菌物质进行了鉴定和比较,初步表明:1.柞蚕致病菌、灭活的柞蚕病毒和微粒子孢子以及柞蚕自身物质均能诱导柞蚕滞育蛹产生抗菌物质,但其活性差异显著,2.上述诱导源诱导柞蚕蛹产生抗菌物质不同组份的相对量和活性在体内持续的时间有明显差异,3.同一诱导源诱导柞蚕蛹产生抗菌物质的不同组份不是同时产生的.也不是同时消失的.     

柞蚕抗病机制及其抗病物质的研究——Ⅱ.不同柞蚕品种滞育蛹诱导抗菌物质活性的比较

本文报道:(1)体腔注射柞蚕空胴病病原菌——柞蚕链球菌(Streptococcus pernyi)能诱导柞蚕蛹产生抗菌物质。以柞蚕链球菌为诱导源,对29个柞蚕二化性品种和辽宁当地一化性品种滞育蛹的诱导试验表明:不同化性和不同品种之间诱导抗菌物质活性存在着明显的差异;(2)不同柞蚕品种滞育蛹诱导抗菌物质活性的产生和达到高峰的时间以及在体内持续时间的长短均有较大差异;(3)对五个不同类型的柞蚕二化性品种和辽宁当地一化性品种滞育蛹的诱导血淋巴进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳谱的比较,初步表明,五个不同类型的二化性品种和辽宁当地一化性品种诱导产生抗菌物质的组份基本相同,但一化性品种的P9A和P9B的相对活性略高于二化性品种。     

不同微生物诱导柞蚕溶菌酶基因的表达分析

溶菌酶是昆虫体液免疫的重要抗菌蛋白质,在昆虫抵御外源物质入侵过程中发挥重要作用。以柞蚕蛹为材料,采用大肠杆菌(Escherichia coli)、蛹虫草菌(Cordyceps militaris)、柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)及无菌水为诱导源,测定不同外源物质诱导柞蚕蛹血淋巴对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)的抑制活性,并根据柞蚕溶菌酶基因(GenBank登录号:DQ353869)设计引物,利用荧光定量PCR技术分析不同外源物质诱导柞蚕蛹血淋巴中溶菌酶基因的表达变化。4个诱导处理组的柞蚕蛹血淋巴均可以产生抑菌活性,但抑菌效果具有显著差异:诱导后72 h柞蚕蛹血淋巴产生明显抑菌效应,抑菌圈直径由小到大依次为无菌水处理组、蛹虫草菌处理组、柞蚕微孢子虫处理组、大肠杆菌处理组,且雌蛹血淋巴的抑菌活性较强。4个诱导处理组柞蚕蛹血淋巴中溶菌酶基因的表达量在诱导后4～8 h内迅速上调,雌蛹和雄蛹中的表达量分别在诱导后24h、8～12 h达到最大,其中,大肠杆菌诱导溶菌酶基因表达上调迅速,但持续时间短,而蛹虫草菌和柞蚕微孢子虫诱导溶菌酶基因的表达量高。研究结果说明柞蚕的免疫应答时间和免疫相关基因的表达水平因诱导源而不同,雌雄个体之间也有差异。     

柞蚕滞育蛹与非滞育蛹蛋白质表达差异初步分析

柞蚕是以蛹滞育越冬的昆虫之一,研究滞育蛹及非滞育蛹的蛋白质种类及含量的变化规律,有利于其滞育机理的解明。通过SDS-PAGE获得滞育与非滞育雄性柞蚕蛹的蛋白质图谱在分子质量16～105 kD范围内均出现清晰的25条带,其中大小为79、54、48、29 kD的蛋白质表达量较高,79 kD的蛋白质为高丰度表达的大分子质量蛋白质;采用2D-PAGE技术分析,在滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为400个,非滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为619个,非滞育蛹蛋白质斑点明显增多,二者蛋白点匹配率仅为37%,蛋白质的等电点变化剧烈,差异性较大,匹配率较低。研究结果提示柞蚕蛹滞育过程中蛋白质的数量和种类发生了明显变化。     

柞蚕幼虫、嫩蛹及滞育蛹营养成分的比较研究

为进一步开发柞蚕的可利用价值,对柞蚕幼虫、嫩蛹（神仙蛹）及滞育蛹的营养成分进行了分析比较,结果表明：蛋白质和脂肪含量均以滞育蛹最高,分别为59．2g／100g和12．1g／100g;总糖和粗多糖含量则以嫩蛹最高,分别为3．0g／100g和5．4g／100g,其中,嫩蛹的粗多糖比柞蚕幼虫高58．8％,比滞育蛹高74．2％;氨基酸总量嫩蛹最高为44．94g／100g,而且其天门冬氨酸和谷氨酸含量也高于柞蚕幼虫和滞育蛹,分别占氨基酸总量的10．68％和12．84％。柞蚕嫩蛹是营养价值较高的昆虫食品,具有较高的开发利用价值。     

蜕皮激素受体和超气门蛋白基因在柞蚕发育过程及激素诱导后的表达模式

昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白形成的异源二聚体介导蜕皮激素信号,起始包括转录因子表达在内的蜕皮级联反应,从而使昆虫进入蜕皮和变态等生命过程。克隆了柞蚕的2个蜕皮激素受体相关基因,命名为Ap EcRB1(Gen Bank登录号:KY411159)和Ap USP1(Gen Bank登录号:KY411160)。2个基因的ORF序列全长分别为1 758 bp、1 401 bp,编码585个、466个氨基酸。半定量RT-PCR检测这2个基因除在柞蚕幼虫血淋巴中不表达之外,在其他组织中均有表达,在丝腺和脂肪体中的表达量较高。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析2个基因在幼虫蜕皮前及化蛹前后呈现大幅度上调表达的规律。注射20-羟基蜕皮甾酮(20E)诱导启动滞育蛹的发育,结果诱导组的滞育蛹经过17 d羽化,比对照组滞育蛹提早羽化。滞育蛹中2个基因的表达量在注射20E后均明显下降,其中Ap EcRB1在蛹发育后期的12 d内一直处于较低水平,但羽化前期其表达量急剧上升,蛹发育16 d(羽化前1 d)达到最高;Ap USP1基因的表达量从注射后8 d开始升高,至16 d时达到最高。以上研究结果丰富了柞蚕变态发育过程中蜕皮激素调控作用的分子信息。     

柞蚕蛹溶菌酶的诱导与提取

本文报道热空气、大肠杆菌K_(12)D_(31)诱导柞蚕蛹(Antheraea pernyi)血淋巴溶菌酶活力提高的最适条件以及从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶.以Sephadex G-50和CM-Sepharose柱层析法从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶,并首次获得柞蚕蛹溶菌酶结晶,溶菌酶制剂比活力达到57353单位/mg蛋白,提高了257倍,总活力回收79.2%.首次应用选择性热变性,等电点沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、包被甲壳素-纤维素亲和层析等分离技术从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶.溶菌酸制剂比活力达25 375单位/mg蛋白,提高了140倍,活力回收51%.用15%、pH4.0聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和3.0-100%.pH6.7-8.9SDS-PAGE鉴定了酶制剂的纯度,并测定了柞蚕蛹溶菌酶的部分氨基酸组成.     

说说柞蚕蛹的开发利用

柞蚕蛹是柞蚕完成吐丝结束后在茧腔内完全变态昆虫,以蛹越冬,是处于蚕的幼虫到成虫发育期之间,是蚕一生积累营养物质的高峰期.柞蚕蛹具活性无异味,是易被人体吸收的低聚母液,既是高蛋白滋补食品,又是营养药膳和美容品;蛹蛋白质多为球蛋白和清蛋白,人体易消化吸收,柞蛹富含精蛋白高达61%,优于肉、蛋、奶、鱼的价值,它富含18种氨基酸,包括人体自身不能合成的8种,且比例均衡,营养学上属全价蛋白源.     

同步辐射软X射线对家蚕生理生化性状的影响

采用一定剂量同步辐射（ＳＲ）软Ｘ射线辐照催青卵及蚕蛹,利用ＰＡＧＥ对蚕卵及蛹子代的蛋白质和酯酶同工酶进行分析,结果发现谱带数目及活性的变化,茧质调查与对照相比也有差异。首次证明ＳＲ软Ｘ射线对家蚕的生理生化性状有一定影响     

柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法

利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体后,分别采用双抗夹心法和竞争法制作胶体金免疫层析试纸条,建立能简便、快捷、准确诊断柞蚕微粒子病的柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法。双抗夹心法和竞争法分别是将柞蚕微孢子虫多克隆抗体与25 nm和17 nm的胶体金颗粒结合并固定在金标垫上,然后均将羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控点(C),但是2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的反应模式不同:前者是以柞蚕微孢子虫多克隆抗体作为检测点(T),而后者以柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为检测点(T)。2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的检测时间均为10 min,检测灵敏度为0.8×107个/mL,与柞蚕血淋巴无交叉反应,特异性强,操作简单,其中,以双抗夹心法制作的试纸条显色更清晰,结果更可靠,更具实用价值。     

Preparation and characterisation of envelope proteins from Haemophilus pleuropneumoniae

Envelope proteins of Haemophilus pleuropneumoniae were extracted by 3 methods and analysed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Three major envelope proteins (45,000 Mr, 41,000 Mr, 31,500 Mr) were distinguished in sonicated cell envelopes together with minor proteins. Using selective solubilisation with sodium lauryl sarcosinate or Triton X-100, outer membrane proteins were distinguished from those of the cytoplasmic membrane. Extraction into LiCl produced a similar profile, but the 41,000 Mr and 31,500 Mr bands were present in reduced amounts. Extraction into saline at 60 degrees C produced a grossly different pattern, with a major band at 20,000 Mr. All 3 major envelope proteins were shown to be heat-modifiable, and the 31,500 Mr band was found to be the non-heat-modified form of a 43,000 Mr protein, which showed similar properties to the Protein d of H. influenzae which is related to the OmpA protein of E. coli K-12. The 45,000 Mr major protein was also weakly associated with the peptidoglycan in SDS/Triton at low temperature.     

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。     

柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕5龄雌雄个体血淋巴蛋白质含量和组成的变化及差异分析

以柞蚕5龄幼虫为材料添食柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi,Np),通过测定与分析不同性别5龄幼虫血淋巴蛋白质含量和组成变化的差异,为探究柞蚕对柞蚕微孢子虫感染的免疫应答提供依据。感染柞蚕微孢子虫的不同性别柞蚕5龄幼虫的血淋巴蛋白质含量随蚕体发育进程出现不同的变化:雌性个体与雄性个体分别在添食Np后24 h与48 h,血淋巴蛋白质含量极显著增加(P<0.01),且持续至添食后96 h,其中雌性个体的血淋巴蛋白质含量又极显著高于雄性个体(P<0.01);在添食Np后120 h,雌、雄个体的血淋巴蛋白质含量与对照组无显著性差异(P>0.05)。SDS-PAGE分析表明,添食Np后的柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质组成与对照组基本一致,均显示出20条分子质量在20.1～97.2 kD的蛋白条带,其中雌、雄个体在添食后96 h,大小约44 kD的蛋白条带明显加深,大小约28 kD的蛋白条带雌性个体在添食后144 h、雄性个体在添食后120 h明显加深,且雄性个体在添食后120～168 h大小约42 kD的蛋白条带明显加深,但在添食后192 h与对照组无明显差异。研究结果说明Np侵染后,柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质的含量及组成均产生了一定的变化,并且雌雄个体间的变化存在差异。     

柞蚕微孢子虫3种孢壁蛋白的提取与鉴定

在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,将发芽后的孢子壳以沸水浴法提取孢壁蛋白最为有效,但操作复杂,部分孢壁蛋白损失严重。初步鉴定从发芽后的孢子壳中提取的编号为P35、P32和P29的3种蛋白属于柞蚕微孢子虫孢壁蛋白,蛋白分子质量分别为35、32、29 kD,其中孢壁蛋白P32的含量最丰富,P35和P29的含量相对较低。根据相应肽指纹图谱预测孢壁蛋白P32的一级结构类似核孔蛋白,可能与孢壁的选择透过性有关,而P35与VASA2n蛋白的一级结构类似,因此有可能与柞蚕微孢子虫的繁殖有关。     

家蚕病原性微孢子虫的蛋白质化学性质的研究

抽提了微 孢子虫的总 蛋白和选择 性分离纯 化了主要 蛋白组 分。对 总蛋白 进行了 酸性 Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、碱性 Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和氨基酸组成分析，并对 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 结果进行了薄层扫描分析。发现每一样品总蛋白在 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 图谱上均分离出３０ 多条蛋白带，均有５ 条主带，但位置不同，各条蛋白带的相对含量不同。氨基酸组成分析结果中发现各种孢子总蛋白所含的氨基酸种类基本相同，均含有１６ 种氨基酸，但各种氨基酸的相对含量不同。对主要蛋白组分进行了 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 氨银染色法纯度鉴定、薄层扫描分析和氨基酸组成分析，发现彼此之间有共同点，但也存在一定的差异。     

人雄激素受体的雄激素结合区cDNA在E.coli中的高效表达

将编码人雄激素受体（ｈＡＲ）的雄素结合区（ＬＢＤ）的ｃＤＮＡ片段（１００５ｂｐ）克隆到由Ｐ１启动子控制的硫氧还蛋白表达载体ｐＴｒｘＦｕｓ上,构建了表达质粒ｐＴｒｘＡＲ,并转化到大肠杆菌Ｇ１７２４中,经色氨酸诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一高效表达的融合蛋白产物,此融合蛋白 分子了量与理论值相吻合,氨基酸组分分析证明了ＬＢＤ目的基因的表达。