葡萄扇叶病毒外蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT－PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物（GFLV－H）基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段，并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector。序列分析结果表明，该基因含有1515个核苷酸，编码504个氨基酸，其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88％和95％。目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121，经三亲交配导入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中。     

葡萄扇叶病毒的ELISA检测技术

本文是关于葡萄扇叶病毒ＥＬＩＳＡ检测技术的报告。采用Ｌ．ｐｉｎｋ的方法提纯病毒，制备了兔抗血清和小鼠腹水抗体，效价分别达１：５１２００和１：５×１０￣６，特异性较强。经间接双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测ＧＦＶ提纯病毒最低浓度为３ｎｇ／ｍｌ。对葡萄的根、幼叶和嫩茎抽提液检测结果一致，稀释倍数１：２０。     

葡萄扇叶病毒杭州分离物 (GFLV-H) P38蛋白基因克隆及序列分析

为了证实GFLV-H P38蛋白的性质及其在寄主扩散中的作用,根据葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus, GFLV)法国分离物F13 RNA2序列合成特异性引物,利用RT-PCR从GFLV-H基因组中扩增出P38蛋白基因的cDNA片段,并克隆到pGEM-T-easy vector上.序列分析表明该基因包含1044个核苷酸,编码347个氨基酸.序列比较发现GFLV-H P38蛋白基因与GFLV-F13对应基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为90%和96%;与线虫传多面体病毒属中的南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus, TomRSV)对应基因氨基酸同源性分别为85%和38.6%,与烟草黑环病毒(Tabacco black ring virus, TBLV)、葡萄铬色花叶病毒(Grapevine chrome mosaic virus, GCMV)和树莓环斑病毒(Raspberry ringspot virus, RRSV) 的同源性均低于30%.     

甘肃葡萄扇叶病毒和卷叶病毒的检测

采用 DAS-ELISA 检测方法对甘肃地区的葡萄主要品种进行扇叶病毒和卷叶病毒的调查和测定。结果表明,这两种病毒病在甘肃地区的主要葡萄产区均有发生。兰州地区和一些老的葡萄产区葡萄带病毒病较严重。通过对比植株下部枝条的幼叶、幼茎、老叶和老茎病原的检测结果,说明植株下部幼嫩组织是卷叶病毒最适的检测部位。     

葡萄扇叶病毒RT-PCR检测技术研究

以扇叶病株为材料,根据病毒编码外壳蛋白的核苷酸序列,设计特异引物P_1(1,064—1,083),P_2(762—781),建立了以RNA为模板的GFLV的RT-PCR检测体系。PCR产物电泳谱带明显,与预期的引物应扩增321 bp片段完全吻合。并利用建立起来的技术体系,对田间葡萄进行了随机取样检测,取得了很好效果。此方法操作简单,检测周期短,准确率高,具有广泛和更进一步的应用价值。     

烟草扭脉病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

烟草丛顶病是近年来在云南省西部的保山、大理等各大烟区频繁爆发流行的一类新的烟草病害。Ｍｏ等认为云南发生的这类病害与津巴布韦发生的由幽影病毒属 (Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ)的烟草丛顶病毒 (Ｔｏｂａｃ ｃｏｂｕｓｈｙｔｏｐｖｉｒｕｓ,ＴＢＴＶ)引起的烟草丛顶病是同一种病。ＳＭＩＴＨ等认为烟草丛顶病由两种病毒———ＴＢＴＶ及黄症病毒科 (Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ)的烟草扭脉病毒(ｔｏｂａｃｃｏｖｅｉｎ ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇｖｉｒｕｓ,ＴＶＤＶ)复合侵染引起。自然界幽影病毒属病毒主要依赖黄症病毒科病毒作为辅助病毒进行蚜…     

葡萄扇叶病和卷叶病的研究现况

葡萄病毒病是葡萄病害中认识较迟而危害最大的病害之一。近年逐渐受到人们的重视,公认的葡萄病毒病约20余种,其中以葡萄扇叶病和卷叶病发生最为普遍。 一、葡萄扇叶病 扇叶病原系欧亚种葡萄(Vitis vinifera)上的一个古老病害,19世纪初叶已有记     

OsWRKY79基因克隆和植物表达载体的构建

WRKY是植物体中重要的转录因子,克隆水稻Os WRKY79基因将为其在植物体内的定位和功能研究奠定基础.根据GenBank公布的Os WRK Y79基因序列设计特异引物,以RT-PCR法从水稻幼苗中克隆OsWRKY79基因,将其亚克隆至含有GFP基冈的pBinGFP表达载体中,经菌落PCR和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pBinGFP-Os WRKY79.     

马铃薯Y病毒黑龙江分离株外壳蛋白基因克隆及序列分析

为研究马铃薯Y病毒的检测方法,参考GenBank中马铃薯Y病毒的全基因序列,应用Primer 6.0引物软件设计并合成了一对特异性引物PVYF、PVYR,利用RT-PCR方法对PVY病毒黑龙江分离株CP基因进行特异性扩增,对扩增片段进行序列测定并进行序列比对。结果表明:引物PVYF、PVYR可以扩增出包含PVY病毒CP基因全长的cDNA特异性片段,序列分析结果表明PVY病毒黑龙江分离株CP基因与GenBank上的40个不同PVY病毒分离株的CP基因氨基酸序列同源性为92.1%~97.4%,说明PVY病毒CP基因保守性较高,可以用作制备PVY病毒血清型检测方法的抗体基因。     

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。     

一株新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株的HN基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株HN基因与另外18个NDV毒株HN基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明,JZ05毒株的HN基因全长1716 bp,HN蛋白由571个氨基酸残基构成,具有5个潜在糖基化位点及13个半胱氨酸残基,第6个潜在糖基化位点(538-540 aa)发生缺失.与另外18个NDV毒株比对,仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有6处.与11个毒株(ZJ1、TJ03、Jlan-1-00、SBZ02、SCL03、JS02、GD05、SQD04、SQZ04、YG、Taiwan95)比对,HN基因序列及其氨基酸序列的同源性均在94%以上;但与3个疫苗毒株(Clone30、LaSota、B1)比对,基因序列的同源性约82%,氨基酸序列的同源性约87%.     

芜菁花叶病毒杭州分离株外壳蛋白基因序列分析

从杭州郊区分离出一个ＴｕＭＶ强毒株系，利用分子克隆和Ｓａｎｇｅｒ双脱氢测序方法分析了其外壳蛋白基因的ＤＮＡ序列．该序列与已报道的其他４种ＴｕＭＶ分离物都具有较高的同源性，最高达９７．６％，最低达８９．５％，其氨基酸序列的同源性更高，最高达９７．９％，最低达９４．５％。本文分析了该序列中ＡＴ和ＧＣ含量，计算了４种核苷酸在有意义链中和在密码子不同位置上的出现频率，同时还分析了该病毒外壳蛋白氨基酸遗传密码的使用频率。     

OsMAPK7基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsCDPK7基因特异引物通过RT-PCR扩增出1 700 bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该序列与GenBank上的OsCDPK7基因序列相比,缺失了CDS序列中157￣234处的78个核苷酸,其编码的蛋白序列缺失了53￣78的26个氨基酸。但是缺失部分位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性中心和钙结合基序等结构域之外,因此预计该基因产物应具备钙依赖的蛋白激酶活性。进一步将OsCDPK7基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBE12和pB29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsCDPK7基因植物表达载体pBC7E12和pBC729A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsCDPK7基因的功能奠定了基础。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

水稻条纹病毒外壳蛋白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白 (CP)和病害特异性蛋白 (SP)是两种与症状密切相关的蛋白 .本文对我国云南 YL分离物的 CP基因和 SP基因进行了克隆和测序 .结果表明 ,CP基因和 SP基因分别由 96 6和 534个核苷酸组成 .与已发表的一些分离物相比 ,YL分离物 CP基因与我国山东 C分离物和日本 T、M分离物的核苷酸序列一致性在 96 .0 %左右 ,氨基酸序列一致性为 97.0 % ,但从序列一致性和碱基变异方式来看 ,C分离物与 T、M分离物的亲缘关系稍近 .YL 分离物 SP基因和云南 CX分离物之间有 99.0 %的核苷酸序列一致性 ,但与 T、M分离物的核苷酸一致性只有 94 .0 %左右 .可见 ,不同分离物间 SP基因的变异与其地理分布有密切的关系 .     

激发子隐地蛋白(cryptogein)基因的克隆及其植物表达载体的构建

从隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)中克隆cryptogein蛋白激发子基因,经测序证实后.针对病原菌侵染和cryptogein基因本身的特点,选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型、并受病原菌诱导的水稻苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的启动子;同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外,更好地与植物细胞膜受体互作,在cryptogein基因前还融合了烟草病程相关蛋白PR1b的信号肽.然后将此融合基因克隆到植物表达载体CHF3中,获得植物双元表达载体CHF3-PAL-PR1b-Cry,再将此载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105中.     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。