基于cpSSR和nSSR标记的地方柑橘资源‘枳雀’亲本分析

【目的】分析地方柑橘资源‘枳雀’的亲本类型和来源,为进一步改良、开发与利用地方柑橘资源提供理论依据。【方法】以包含‘枳雀’在内的分属于柑橘属、枳属、金柑属的21份柑橘种质为材料,运用cpSSR和nSSR标记计算各SSR位点等位基因数(Na)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon信息指数(I)、多态性信息含量(PIC),构建基于DICE相似系数的UPGMA(非加权配对算术平均法)聚类树,进而分析‘枳雀’的亲本来源。【结果】10对cpSSR引物扩增出37个多态性条带,平均每个位点3.70个,平均Shannon信息指数(I)为0.98;14对nSSR引物扩增出62个多态性条带,平均每个位点4.43个,平均多态性信息含量(PIC)为0.57,平均期望杂合度(He)为0.63。【结论】根据cpSSR和n SSR分析,结合形态学证据,认为‘枳雀’的母系亲本为柚类或者具有柚类母本血缘的杂交柑橘品种,父本是一个具有枳的血缘的杂交柑橘品种。cpSSR与nSSR结合使用可比较准确地鉴定柑橘杂种。     

白菜型油菜和菜薹的InDel 标记开发及其RILs群体遗传连锁图谱的构建

 通过白菜型油菜‘R-O-18’和菜薹‘L58’的基因组重测序数据与白菜基因组的参考序列（‘Chiifu-401-42’的基因组序列）的比对,在全基因组范围内检测到了18 479 个短插入缺失变异位点（≤5 bp）。从中挑选了500 个插入/缺失片段为4 ~ 5 bp 的InDel 变异位点,将其设计成InDel 分子标记并进行试验验证,结果有452 个标记通过PCR 扩增出单一条带,但仅有106 个在‘R-O-18’和‘L58’间表现出多态性,346 个没有多态性,48 个在PCR 中没有扩增。亲本间具有多态性的106 个InDel 标记可用来检测以‘R-O-18’和‘L58’为亲本构建的RILs 基因型,并构建了一张包含99 个标记的遗传连锁图谱。     

柑橘天然杂种秭归橘橙来源探究

秭归橘橙为天然柑橘杂种,果实无核、早熟,但其亲本来源未得到深入的分析和验证。为探明秭归橘橙的亲本,应用倍性检测、形态学标记和AFLP、cpSSR、nSSR等分子标记,对其进行遗传鉴定。倍性检测证实秭归橘橙为二倍体,叶形指数、气孔密度和大小、花粉育性和花粉形态分析表明秭归橘橙形态特征上偏向于甜橙,而其花粉染色活力介于甜橙与红橘之间。AFLP聚类分析表明秭归橘橙介于橙和橘之间。cpSSR、nSSR确认秭归橘橙的母本为甜橙(Citrus sinensis[L.]Osbeck),父本为橘类(C.reticulate Blanco)。     

嫁接嵌合体‘早红’脐橙果实细胞来源鉴定及其糖酸和香气物质分析

‘早红’脐橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck + C. unshiu Marc.]是来自‘罗伯逊’脐橙[C. sinensis （L.）Osbeck]和‘国庆1号’温州蜜柑（C. unshiu Marc.）的嫁接嵌合体。采用SSR和CpSSR分子标记分析了‘早红’脐橙的叶片、汁胞、囊瓣壁和白皮层的细胞来源,采用气相色谱（GC）和顶空固相微萃取-气质联用（HS–SPME–GC–MS）的方法测定了‘早红’脐橙及其两个嫁接亲本的可溶性糖和有机酸含量,以及果皮和果肉的香气物质。结果表明,‘早红’脐橙汁胞和囊瓣壁中均含有两个亲本的遗传物质,果肉中的有机酸含量显著低于两个亲本,果皮中的香气物质与‘罗伯逊’脐橙果皮基本一致,但是果肉中的香气物质与两个亲本都不尽相同。     

利用SSR 标记进行枣树子代苗父本鉴定

 利用SSR标记技术对‘冬枣’自然授粉实生苗1 728株和‘灵宝大枣’自然授粉实生苗530株进行父本鉴定,利用可能的父本材料从376对引物中筛选出8对条带清晰、多态性较高且具有高度区分度的引物。采用荧光M13毛细管电泳技术,用这8对引物在亲本材料中共检测到45个多态等位条带,每对引物的平均多态条带数为5.625,PIC值变幅为0.58 ~ 0.86,平均为0.71。利用Cervus3.0软件对具有8对引物数据的子代进行父本分析,鉴定出‘冬枣’ב木枣’实生苗399株、‘冬枣’ב小芽枣’实生苗390株、‘冬枣’ב映山红’实生苗357株、‘灵宝大枣’ב紫圆枣’（‘紫枣’）实生苗204株、‘灵宝大枣’ב柿饼枣’实生苗126株。     

龙眼正反交后代的SSR鉴定及遗传多样性分析

以龙眼早熟优质品种‘石硖’与浓香型晚熟新品种‘香脆’的正、反交F1代共124株为试材,利用SSR标记鉴定杂种真实性,结合高接后的始花年龄和果实香气性状对杂交群体进行遗传多样性分析。结果表明：在20对龙眼基因组SSR引物与50对荔枝表达序列标签SSR引物中,筛选出双亲多态性引物9对,多态性引物占比为12.86%,其中6对引物可鉴定出112株‘石硖’ב香脆’杂交苗中的110株真杂种,真杂种比例为98.21%;4对引物可鉴定出12株‘香脆’ב石硖’杂交苗中的11株真杂种,真杂种比例为91.67%。UPGMA聚类分析显示,121株正、反交后代的遗传变异较大,可划分为3个大类5个亚类。正交与反交后代中,短始花年龄的植株（2.5年生）比例为31.58%和28.57%,中等始花年龄的植株（3.5 ~ 4.5年生）比例为68.42%和57.14%,长始花年龄的植株（≥ 5.5年）比例为0和14.29%;果实香气表现出无、淡、浓的广泛变异。     

应用cpSSR和EST-SSR标记进行柑橘特异种质资源遗传背景研究

将叶绿体SSR 和EST-SSR 标记用于揭示柑橘及其近缘属的系统发育关系,并阐明保存在重庆国家果树种质柑橘圃内一些特异种质资源的遗传背景。其中50 份材料和44 份材料分别用cpSSR 和EST-SSR 分析。22 对cpSSR 引物产生146 个多态性条带,平均检测到6.64 个多态性条带,平均Shannon’s多样性指数为0.32;18 对EST-SSR 引物产生240 个多态性条带,平均检测到 13.3 个多态性条带,平均多态信息含量（PIC）为0.73,平均期望杂合度为0.78。根据cpSSR 和EST-SSR 分析,结合形态学证据,阐明一些特异柑橘种质资源的遗传背景,同时证明莽山野橘、元橘、宜昌橙有较近的亲缘关系。     

高羊茅EST-SSR标记开发及遗传多样性分析

采用从其他作物转移与利用自身EST序列设计两种方法为高羊茅（Festuca arundinacea L.）开发EST-SSR分子标记,并利用所开发标记对高羊茅品种（系）进行遗传多样性分析。利用来自小麦、大麦、玉米、高粱和水稻的732对EST-SSR在高羊茅上进行通用性分析,得到406个有效的扩增引物对（55.46%）。利用高羊茅EST数据库（GenBank/dbEST）中63 853条EST序列进行微卫星序列的查找,共发现包含微卫星的EST序列420条,占整个EST总数的0.658%。其中三核苷酸基序出现频率最高（43.33%）,次之为二核苷酸基序（33.57%）。二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高（16.90%）,三核苷酸基序以CAG/GTC出现的频率最高（10.63%）。进一步运用Primer 5.0软件设计了108个引物对,并交上海桑尼公司合成。PCR检测表明,92个引物对（85.19%）在高羊茅中均可以扩增出稳定清晰的带型。从498对（其中5种作物的406对,高羊茅的92对）有效扩增的EST-SSR引物中随机选取81对引物,对12个高羊茅品种（系）进行扩增。79个引物对显示出多态性（97.53%）。共检测到133个等位变异,平均每对引物有1.68个等位变异;多态性信息含量（PIC）值最高为0.66,最低为0.14,平均为0.48。聚类分析结果表明,12份材料在相似系数为0.61处可分为5大类：第Ⅰ类为‘爆发力’和‘法思’;第Ⅱ类为‘强劲’、‘家园’和‘翠碧A’;第Ⅲ类为‘可其思3号’和‘凌志’;第Ⅳ类为‘雅典娜2号’、‘美洲虎3号’、‘火凤凰’和‘TF160’;‘球道’单独为第Ⅴ类。     

苹果对炭疽菌叶枯病抗性遗传的研究及其分子标记筛选

利用两个对炭疽菌叶枯病高抗的苹果品种（系）‘富士’和‘QF-2’及两个高感品种‘金冠’和‘嘎拉’为亲本配制了4个杂交群体‘富士’ב金冠’,‘金冠’ב富士’,‘嘎拉’ב富士’,‘富士’בQF-2’。以F1群体植株为试验材料,对苹果炭疽菌叶枯病的抗性进行鉴定评价和遗传分析。结果表明,4个群体中抗、感植株的分离比分别符合1︰1,1︰1,0︰1和1︰0的理论比值,初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制,抗病基因型为rr,感病基因型为RR和Rr。以‘金冠’ב富士’F1群体为试材,采用分离群体分组分析（BSA）方法,通过对均匀覆盖苹果染色体组的500对SSR引物的筛选,获得了一个与抗病性状相关的分子标记S0506206-24,该标记与抗性基因位点的连锁距离为9.8 cM。     

桂花SCoT标记体系的建立及其在遗传多样性分析中的应用

以‘籽银桂’桂花叶片DNA为材料,以2 × Es TaqMasterMix 预混液为基本体系,针对影响SCoT-PCR反应的退火温度、模板DNA用量、引物浓度等因素进行优化,建立了适于桂花SCoT分子标记的反应体系。12 μL反应体系含有30 ng模板DNA,引物浓度为0.4 μmol ? L-1,不同的引物退火温度分别为48、49.9、54.3或56 ℃。利用该体系对12个桂花品种进行分析,扩增条带清晰,扩增产物在150 ~ 2 200 bp之间。12 条引物共扩增出244条带,其中多态性条带238条,多态性比率为97.47%。在相似系数0.57水平处,‘九龙桂’形成第Ⅰ组,其余11个品种形成第Ⅱ组。第Ⅱ组中‘柳叶桂’、‘香云’、‘早籽黄’、‘大花金桂’、‘桂冠籽金桂’、‘鹅黄’、‘籽金桂’和‘醉云’8个花色不完全相同的品种聚在一起;‘金桂’、‘早银桂’和‘籽银桂’3个不同花色的品种聚在一起,说明品种间的亲缘关系与花色不完全相关,这与其它分子标记结果一致。     

胡萝卜品种资源遗传多样性及亲缘关系研究

结合表型和SSR标记对29份中国胡萝卜地方资源、40份橘色栽培品种以及1份土耳其紫色品种进行遗传多样性和亲缘关系研究。田间农艺性状多样性分析表明,除叶长、根长、根粗外,春秋两季胡萝卜橘色栽培品种的多样性指数平均值低于地方资源。主成分分析结果表明,中国橘色地方资源和橘色栽培品种表型在秋季较为相似,但在春季差异较大。利用38对SSR引物对胡萝卜品种进行扩增,共扩增出133个多态性位点,其中中国地方资源与橘色栽培品种的平均多态性位点数分别为4.2和2.9个。中国地方资源的多态性信息含量值(0.74±0.06)明显高于橘色栽培品种(0.42±0.03)。聚类分析将供试胡萝卜材料分为2组,第I组包括所有橘色栽培品种和橘色地方资源B0241,第Ⅱ组包含其他地方资源和紫色品种L1。     

油梨转录组SSR分子标记开发与种质资源亲缘关系分析

选取海南大学油梨种质资源圃的‘Fuerte’油梨花朵和小果进行转录组测序，获得18 010条序列，总长度为29 422 056 bp。利用MISA软件检索转录组测序数据，获得分布于4 687个序列中的6 312个SSR位点。经统计发现，SSR在所检测的序列中出现的频率为35.05%。分析SSR位点特征显示，所有类型的SSR平均长度为18.90 bp，SSR之间的平均距离为4.66 kb。‘Fuerte’油梨转录组中SSR序列以二核苷酸、三核苷酸重复类型为主，两者占SSR总数的87.15%。二、三、四核苷酸重复类型中优势基元分别为AG/CT、AAG/CTT、AAAT/ATTT。利用Primer 3.0对SSR序列设计引物13 398对。以32份油梨种质资源为研究对象，对随机挑选的100对SSR引物进行有效性验证，并用于对这些油梨种质进行亲缘关系分析。发现其中40对引物具良好多态性，共扩增出219条谱带，其中171条为多态性谱带。经计算，平均每对引物产生4.275个多态性片段。He和PIC均值分别为0.529和0.456。UPGMA聚类和PCA分析结果较一致，在系数设定为0.74时可将32份油梨种质分为4大类，与地理分布有一定的关系。     

利用SSR荧光标记构建92个梨品种指纹图谱

 利用SSR荧光标记技术筛选出的10对SSR荧光标记引物,构建中国建国以后选育的92个梨品种的SSR指纹图谱。10对SSR引物共扩增出132个等位基因,位点的杂合度在0.2421 ~ 0.8632之间。10对引物的扩增带型为8 ~ 44个,平均为29.7个。利用其中5对引物KA16、NH009b、NH013a、CH02b121和CH05d04可区分所有供试品种。92个梨品种10个SSR位点的遗传多样性和多态性信息含量的变化范围分别为0.4886 ~ 0.8810和0.4537 ~ 0.8707,平均值分别为0.7920和0.7732。92个梨品种的SSR指纹图谱互不相同,可以作为各品种特定的图谱,为品种鉴别提供依据。     

韭菜全长转录组SSR信息分析及分子标记开发

利用MISA软件筛选韭菜（Allium tuberosum）全长转录组测序获得的49 876条（大于500 bp）转录本序列（89.44 Mb），共检测出13 111个SSR位点，分布在10 332条转录本中，SSR出现频率为26.29%，平均分布距离为6.82 kb。在搜索的6种SSR位点类型中，1 ~ 3个核苷酸重复类型占主要地位，占总SSR位点数的98.74%，其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复类型分别为66.55%、12.52%、19.67%。发现重复序列的基序有103个，其中二核苷酸和三核苷酸重复类型中出现频率高的基序有AC/GT（2.54%）、CA/TG（2.29%）、GAA/TTC（1.85%）和AAG/CTT（1.60%）。重复序列的长度在10 ~ 289 bp之间，其中小于20 bp的有11 128个（84.88%），大于20 bp的有1 983个（15.12%）。根据这些SSR位点，共设计出3 311对SSR引物，在随机选取的208对引物中有164对（78.85%）能进行有效扩增，其中39对引物在24份韭菜种质资源中表现出多态性。利用多态性引物SSR41，鉴定出‘马蔺韭’ב791’后代中的6株有性生殖后代。以上结果表明，基于韭菜全长转录组测序开发的SSR标记可以为韭菜的遗传多样性分析、种质资源鉴定和有性生殖后代筛选提供充足可靠的标记来源。     

胡萝卜始花期、主薹高和单株种子量的QTL分析

以‘松滋野生’胡萝卜和橘色栽培品种‘Amsterdam’构建的回交重组自交系为试材,深入分析‘松滋野生’染色体片段对后代植株始花期、主薹高及单株种子量的遗传影响。试验结果表明,始花期在两年间均为偏正态分布,而主薹高均呈正态分布,单株种子量仅在2015年表现为正态分布。方差分析表明,3个性状在基因型间、年份间、基因型 × 年份间存在极显著差异。基于最新胡萝卜基因组数据构建了一张含有2 027个Bin（共154 776个SNP标记）,总图距为1 436.433 cM,平均图距0.709 cM的遗传图谱。QTL定位分别获得了2、4、2个与始花期、主薹高和单株种子量相关位点,表型贡献率在14.6% ~ 23.8%之间,其中始花期位点DIF5-1和主薹高位点MSL5-1位置重叠。     

葡萄SNP 标记的CAPS 和TSP 分析

 为了建立起葡萄SNP 标记分析的一般方法和探索EST-SNP 标记在葡萄中的应用，对前期开 发的葡萄EST-SNP 位点进行了筛选，设计了28 对CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences，酶切 扩增多态性序列）标记引物和22 对TSP（Temperature-switch PCR，温度转变PCR）标记引物，并在31 份葡萄材料中进行了分析，其中20 对CAPS 引物和10 对TSP 引物电泳条带较清晰，多态性较好。基 因分型统计显示：所有的SNP 位点均含有2 个等位基因，平均多态性信息含量（PIC）为0.336，平均 Shannon’s 信息指数为0.511。基因分型和葡萄材料聚类结果均显示这两种方法所获结果提供的信息量大且 结果可靠。本方法简便、成本低，可作为SNP 分型有效方法用于葡萄品种鉴定、基因分型和遗传多样性 分析等。     

Development of specific primers for cpSSR analysis in caper,olive and grapevine using consensus chloroplast primer pairs

Chloroplast SSR (cpSSR) markers have demonstrated utility in studying genetic relationships. DNA sequence information of the chloroplast genome is necessary for the development of cpSSR primer pairs. To overcome this limitation, “consensus” primers have been developed to amplify the homologous regions in plants where chloroplast sequences are not available. However, 80% Pinus thunbergi and Nicotiana tabacum developed “consensus” primers tested with grapevine, olive and caper showed multi-locus patterns. The presence of multi-locus patterns requires the use of agarose gel electrophoresis followed from isolation and sequencing of the bands. Herein, a PCR-strategy is proposed to construct specific cpSSR primer pairs without genomic sequence information, giving single-band amplifications that can be directly sequenced. Twelve new specific cpSSR primer pairs were developed for Capparis spinosa L., Olea europea L. and Vitis vinifera L. PCR products were sequenced to confirm the presence of microsatellite sequences, and their transportability was tested on six V. vinifera cultivars. Both single-nucleotide polymorphisms and polymorphic cpSSR were observed in the six grapevine cultivars using the specific cpSSR primers.     

基于形态学标记及SSR 标记的甜瓜主栽品种分类鉴定研究

利用形态学标记、SSR 分子标记技术对市场上广泛种植的甜瓜品种进行分类鉴定。利用形态学聚类分析，得到60份材料间的相似系数为0.73～0.94，在相似系数为0.74 处，60 份甜瓜材料被分为2 类，为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜；在相似系数为0.77 处，薄皮甜瓜按照单果质量、熟性、果皮底色、芳香气分为4 组，实现初步分类。经过SSR 标记聚类分析，得到60 份材料间的相似系数为0.75～0.95，当相似系数为 0.77 时，可以将所有供试材料分为6 类。利用SSR 分子标记技术，为60 份不同甜瓜品种构建唯一的指纹图谱。18 对SSR 引物，每对引物可以检测到4～11 条数目不等的多态性条带，平均为8 条。多态性信息含量（PIC）平均为0.71，变化范围为0.58～0.88。采用QR 编码为60 份甜瓜材料构建了唯一的指纹图谱。试验结果表明形态学标记对60 份材料实现初步分类，SSR 分子标记则能够有效地区别60 份材料，并且为建立甜瓜品种的核酸指纹图谱库提供了理论数据，实现对甜瓜品种进行快速、准确的鉴定。