我国梨腐烂病病原菌的初步鉴定及序列分析

【目的】为了对我国梨腐烂病病原菌进行初步鉴定和序列分析,【方法】从我国15个省(市)梨产区采集腐烂病样品并观察其田间危害症状,通过组织分离法分离获得168份梨腐烂病菌分离株,从中选取72份进行单孢纯化,共获得79份梨腐烂病菌纯化分离株;观察在PDA、25℃黑暗条件下病原菌菌落形态以及产孢体形态,并对其在梨枝条上产生的分生孢子器徒手切片置显微镜下观察其结构特征和分生孢子形态;采用菌丝块接种法测定梨腐烂病菌在‘翠冠’梨离体枝条上的致病力。对部分菌株rDNA-ITS进行PCR扩增、测序,利用BLAST软件与GenBank数据库进行序列相似性分析,并用MEGA 4.1和邻接法构建系统发育树。【结果】根据梨腐烂病菌各分离株在PDA上的菌落形态特征可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种菌落类型,不同梨腐烂病菌分离株在PDA上产生多种类型的产孢体,不同梨腐烂病菌菌株在离体梨树枝条上的致病力存在差异,我国梨腐烂病菌的rDNA-ITS核苷酸序列一致率为99.98%~100%,与苹果腐烂病菌分别聚在同一亚组的两个分支。【结论】我国梨腐烂病病原菌存在不同的菌落类型,其rDNA-ITS核苷酸序列分析显示均为V.mali var.pyri。     

腐烂病菌的GFP标记及其在梨叶片组织中的侵染和扩展观察

【目的】明确梨腐烂病菌强、弱致病力菌株在梨树叶片组织中的侵染及扩展情况。【方法】利用农杆菌介导的遗传转化(agrobacterium-mediated transformation technique,ATMT)方法对梨腐烂病菌强、弱致病力菌株进行绿色荧光蛋白(green looresent protein,GFP)标记,并筛选出和野生型菌株比较在生长速度、培养特性以及致病力都没有发生显著变化的阳性转化子菌株;利用荧光显微技术观察其在梨树叶片组织中的侵染和扩展,比较强、弱致病力菌株的侵染差异。【结果】强、弱致病力菌株在叶片上侵染存在差异。菌丝主要在叶片的上表皮扩展,菌丝扩展前端的叶片组织颜色发生变化,形成一段变色带,强致病力菌株侵染形成的变色带较弱致病力菌株形成的变色带宽,强致病力菌株菌丝在叶片组织上的分布较稀疏。【结论】梨腐烂病菌菌丝主要在叶片的上表皮组织扩展;强致病力菌株的侵入能力较强,其在叶片上扩展时菌丝分布较稀疏,扩展前端形成的变色带宽。     

梨Dof家族基因鉴定及其在宿存与脱落萼片中的表达分析

根据苹果、拟南芥等植物中的Dof转录因子基因序列,利用BLAST软件鉴定到梨基因组中51个PbDof基因,分为9个亚家族。基因结构分析表明,PbDof的内含子数为1～3个;启动子区域含有5种胁迫响应和9种植物激素的顺式调控元件;基因复制结果显示,PbDof在物种进化过程中主要受纯化选择的作用。以蒸馏水为对照,于‘库尔勒香梨’盛花期喷施外源GA3和PP333,并采qRT-PCR技术检测各处理条件下宿萼组和脱萼组子房和萼片中PbDof的表达情况。结果表明,处理9d后,PbDof34和PbDof51的表达量在GA3处理宿萼组萼片中均显著高于PP333处理脱萼组,且PbDof34显著高于对照;而PbDof16、PbDof19和PbDof44的表达量在GA3处理宿萼组萼片中均低于PP333处理脱萼组;此外,PbDof16和PbDof44的表达量在PP333处理脱萼组萼片中均显著高于对照。因此,PbDof34和PbDof51可能正向调控萼片宿存,PbDof16、PbDof19和PbDof44可能正向调控萼片脱落。     

柑橘HSP20家族基因鉴定及其响应溃疡病菌侵染表达分析

为探究HSP20在柑橘（Citrus L.）响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染过程中发挥的作用,鉴定CsHSP20家族基因。生物学信息分析显示共有42个,分为11个亚族,分布在9条染色体上,编码135～373个氨基酸,蛋白分子量15.17～41.71 kD,等电点4.53～10.07,92.9%的基因没有或只有1个内含子,各亚族基因间有高度相似的结构和保守基序,每个基因的启动子都具有与激素或胁迫相关的顺式作用元件。其次,对感病的冰糖橙和抗病的枸橼C-05进行接种Xcc和40℃热胁迫处理,qRT-PCR结果显示CsHSP20家族中的HSP17.9、HSP23.3、HSP18.5和HSP18.0均上调表达,但抗感材料之间差异明显,HSP23.3在枸橼C-05中受Xcc上调表达水平极显著,该结果与受Xcc侵染的转录组结果一致。在冰糖橙叶片瞬时超表达候选基因,Xcc定量分析结果显示枸橼C-05的HSP23.3抑制Xcc繁殖速度更明显。     

苹果ELO家族基因鉴定及其在低温胁迫下的表达分析

为研究苹果ELO家族基因在蜡质合成及抗寒中的作用,利用生物信息的方法对苹果全基因组中的ELO家族成员进行鉴定与分析。结果表明,MdELO基因家族共包含7个成员,不均匀地分布在苹果的3条染色体（Chr2、Chr8和Chr15）上。MdELO蛋白包含211～305个不等的氨基酸残基,等电点在9.43～11.62之间。亚细胞定位结果表明,MdELO蛋白在细胞核、细胞膜和叶绿体中有分布。顺式作用元件分析表明,7个MdELO启动子上游2 000 bp序列分布有激素、环境适应性和逆境诱导等响应元件。进一步测定越冬期不同品种苹果枝条中的蜡质含量,结果显示,从初休眠期至萌芽期,蜡质含量呈逐渐下降趋势,且抗寒性强的‘俄矮元帅’蜡质含量显著高于‘宫崎短富’;从蜡质形态及枝条表皮形态来看,‘俄矮元帅’蜡质呈针芒状且分布紧密,其枝条表皮结构紧密,表面光滑,而‘宫崎短富’蜡质呈散块状,枝条表皮结构松散,表面粗糙;两种苹果枝条的脯氨酸含量、相对电导率和淀粉磷酸化酶活性随越冬期的延长呈先升后降的趋势,淀粉酶活性呈逐渐上升的趋势,其中‘俄矮元帅’各指标均高于‘宫崎短富’。综上表明‘俄矮元帅’抗寒性显著高于‘宫崎短富’...     

梨种质资源对腐烂病抗性的室内评价

采用离体枝条分生孢子悬浮液和菌丝块接种测定了11 种梨种质资源共211 份材料对腐烂病的抗性。结果显示：不同种质资源对病菌的侵入和扩展的抵抗均存在差异,抗侵入的占17.5%,抗扩展的占35.1%;同一种质资源对病菌侵入与扩展的抵抗之间也有差异,对病菌侵入和扩展抵抗一致的占30.3%,不一致的占69.7%;所有供试材料中对病菌侵入和扩展均为高抗（HR/HR）的占1.4%,抗病（R/R）的占4.7%,中等（M/M）的占12.3%,感病（S/S）的占10.9%,高感（HS/HS）的占0.9%;通过综合抗性评价发现,‘大香水’、‘杜梨’、‘江岛’、‘康德’、‘龙泉酥’、‘苹果梨’、‘山梨’、‘云红1 号’、‘早玉’和‘长十郎’为抗病（R/R）材料,‘新高’、‘武豆9 号’和‘荆杜3 号’为高抗（HR/HR）材料,‘新星’和‘新黄’为高感（HS/HS）材料。     

梨Trihelix转录因子家族成员鉴定及表达分析

Trihelix转录因子可以和光应答相关的GT元件结合,因此又称GT转录因子。本研究从梨基因组中鉴定出16个Trihelix家族基因,依次命名为PbGT1～PbGT16,从同属于蔷薇科的草莓和桃基因组中分别鉴定出11和16个Trihelix家族基因。染色体定位与基因复制事件分析表明,梨、草莓和桃Trihelix家族成员分别分布在12、6和8条染色体上,且梨Trihelix家族存在片段复制事件。种间系统进化树分析表明,梨、草莓和桃Trihelix家族成员分为6个亚族,梨家族成员(PbGT)属于GT-2、Subfamily O和SIP1亚族。结合进化关系及qRT-PCR验证,筛选出PbGT15可能参与调控梨果实石细胞团木质化。     

从病菌自剪锯口木质部侵染再谈苹果树腐烂病的防治

苹果树腐烂病是苹果树的重要病害,笔者最近研究发现苹果树腐烂病病菌能从剪锯口的木质部侵入,病菌侵染后在木质部生长扩展或潜伏,条件适宜时扩展到达皮层,导致发病;从枝干表层或伤口侵染的病菌主要在枝干表层或伤口死组织内生长潜伏,条件适宜时突破栓皮层到达皮层致病。对于苹果树腐烂病应从苗期和幼树期开始保护剪锯口、伤口和枝干,防止病菌侵染;当树体受侵染或发病后,应彻底铲除带菌组织;当无法彻底铲除潜伏病菌时,应保持健旺树势,防止潜伏病菌扩展致病。     

梨BAHD家族基因的鉴定及石细胞分化相关成员的筛选

[目的]在全基因组水平鉴定梨酰基辅酶A依赖型酰基转移酶(BAHD)家族基因,系统分析其在果实发育过程中的生物学功能,并筛选出与梨果实石细胞分化相关的BAHD家族成员.[方法]以Pfam转移酶家族蛋白质结构模型(PF02458)和模式植物HCT基因为参考,通过BAHD家族的保守基序HXXXD和DFGWG来鉴定梨BAHD家...     

大白菜LEA家族基因的鉴定及其部分成员在低温胁迫下的表达分析

基于大白菜全基因组数据对LEA家族基因进行全基因组鉴定与生物信息学分析,研究其序列特征、基因结构、启动子顺式作用元件、染色体定位、进化关系以及在不同组织中和低温胁迫下的表达模式.从大白菜基因组中总共鉴定出65个LEA家族基因成员,根据系统发育与保守基序分析,其可分为8个组;内含子较少,且不均匀地分布在10条染色体上,另...     

苹果L-LEC-RLK基因家族鉴定及响应病原真菌信号的表达分析

以L型类凝集素(Lectin-LegB;Pfam:PF00139)和激酶(Pkinase;Pfam:PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,鉴定了苹果(Malus×domestica Borkh.)L型类凝集素类受体激酶(L-LectinReceptor-like kinase,L-LEC-RLK)家族成员,并对其理化性状、进化特征、亚细胞定位、染色体位置和表达模式进行分析。通过鉴定,共获得41个成员,其氨基酸序列大小介于423～1 291 aa,分子量介于47.12～143.27 kD,等电点介于5.50～8.91,其中28个成员位于质膜。根据进化分析将拟南芥、水稻、马铃薯、杨树和苹果等5个物种的L-LEC-RLKs分为8个亚组,苹果L-LEC-RLKs分布于亚组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ。染色体位置分析表明苹果L-LEC-RLKs存在多个串联重复。该家族成员在不同组织中存在多样化的表达模式。27个成员在苹果接种腐烂病菌(Valsa mali,Vm)或斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype,AAAP)后存在差异表达。其中,MD15G1226500和MD14G1055200的表达量在两种病害发生后都发生了显著的差异。以上差异基因可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。     

苹果全基因组多聚半乳糖醛酸酶基因家族的鉴定及进化分析

从苹果全基因组中鉴定出85个多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因,通过聚类分析将其分成了7个组(Group A~Group G),其分子量在176~1 125 aa之间,等电点在4.68~9.58之间。鉴定出来的Md PG基因除在14号染色体没有分布外,其余都有分布。系统分析了Md PG蛋白的保守基序和Md PG基因结构,发现苹果PG蛋白除包含有广泛存在于各种PG蛋白的4个保守基序以外,还含有其他相对特异的保守基序,Md PG75具有最多的外显子数,达到18个。对85个苹果PG蛋白之间的功能联系网络进行了系统研究,分析预测了相关基因的功能和多个基因间功能的联系,并作了初步验证。     

苹果K~+转运蛋白基因家族鉴定及表达分析

利用苹果基因组筛选K~+转运蛋白基因,分析其系统发育关系,通过q RT-PCR检测它们在平邑甜茶各器官组织和不同发育阶段果实的表达特征。结果表明,在苹果中存在65个K~+转运蛋白基因,包括CHX家族(33个)、HAK家族(24个)、HKT家族(1个)和KEA家族(7个),它们与拟南芥K~+转运蛋白基因高度同源,其基因结构相对保守,并且不均匀地分布在13条染色体上。定量表达分析发现,K~+转运蛋白基因具有不同的表达模式,其中在根中高度表达的32个,在叶片中高度表达的12个,在茎尖中高度表达的11个,在果实中高度表达的19个。研究结果为揭示苹果K~+转运蛋白基因的功能提供了基础资料。     

植物Gly-RLK基因家族鉴定及其在苹果中的表达分析

类受体激酶(receptor like kinase,RLK)在植物生长发育和环境适应中起重要作用。前期研究发现苹果(Malus′domestica)中存在一类具有Glyco₁8胞外结构域(SM000636或SM000704)的RLK,命名为Glyco₁8-RLK(Gly-RLK)。本试验中以Glyco₁8和Pkinase(SM000220)保守域全蛋白序列为种子序列,对53种被子植物基因组中的Gly-RLK进行鉴定,并分析其进化特征;明确苹果Gly-RLK(MdGly-RLK)的理化性状、亚细胞定位,基因在染色体上的分布、启动子区域的顺式作用元件和表达模式。结果表明,仅19种植物中存在Gly-RLK,家族成员数介于1～20,单子叶植物中均未发现该家族成员。根据进化分析将其分为8个亚组,亚组Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ分布基因数较多。共发现6个MdGly-RLK,其编码的氨基酸序列大小、分子量和等电点分别介于451～776、50.99～87.33 kD和5.95～8.21,主要位于质膜,4个为串联重复。MdGly-RLK在苹果各组织和品种...     

桃MRLK家族全基因组鉴定及蚜虫侵染后的表达分析

以Malectin(PF11721)、Malectin-like(PF12819)和Pkinase(PF07714)保守域全蛋白序列为种子序列,鉴定桃(Prunus persica)基因组中全部MRLK类受体激酶(Malectin receptor-like kinases)家族成员,并利用转录组测序分析桃绿蚜侵染不同时间MRLK在抗蚜和感蚜品系材料中的表达情况。利用生物信息学手段进行分析,共获得41个MRLK家族成员,这些基因分布在桃的8条染色体上。家族成员氨基酸数量介于391～1 035 aa,分子量44.05～115.09 kD,等电点5.38～9.16。分析系统进化树发现拟南芥、水稻和桃的MRLK家族分为5个亚组,其中桃MRLK家族成员分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚组上。亚细胞定位预测显示该家族成员全部定位在细胞膜上。顺式作用元件预测结果显示该家族成员启动子包含光、激素以及响应生物与非生物胁迫的作用元件。桃绿蚜侵染结果表明,桃MRLK家族中19个基因在5个桃材料中均未表达,15个基因在抗蚜品系‘P5868’与其他4个材料之间无差异表达。Pp MRLK2、Pp MRLK9、Pp MRLK22...     

辣椒bZIP家族基因的鉴定与表达分析

利用生物信息学的方法对辣椒bZIP家族基因进行全面鉴定与进化分析,并在此基础上对基因染色体定位、蛋白质保守基序和基因结构等进行分析,并通过qRT-PCR方法检测基因的组织表达模式和在ABA胁迫下的应答等。结果表明,从辣椒基因组中共鉴定出54个bZIP家族基因,这些基因分散分布在辣椒的11条染色体上;系统进化分析表明辣椒bZIP基因家族可以分为10组,每组所含有的基因数不等;该家族成员每个基因含有0 ~ 11个内含子;bZIP家族基因具有不同的表达模式;外源激素ABA处理可以明显抑制或者激活该家族基因成员的表达。     

辣椒热激蛋白HSP90家族基因鉴定及分析

借助生物信息学工具对辣椒热激蛋白HSP90家族基因进行鉴定,并分析其理化性质、结构特征、系统进化关系以及在各组织器官和高温胁迫下的表达模式。结果表明,辣椒基因组中含有7个HSP90家族基因,分布于5条染色体上,内含子数2～19不等,含有5个保守基序;系统进化关系分析显示辣椒7个HSP90家族基因分为3组;亚细胞定位结果显示辣椒HSP90蛋白定位于细胞质与内质网中;基于已发表的转录组数据进行组织表达分析,HSP90在不同组织中的表达模式不同;高温处理可不同程度地激活HSP90的表达。     

辣椒GRAS家族全基因组鉴定与表达分析

基于辣椒全基因组数据信息,利用生物信息学方法对CaGRAS基因家族进行了系统鉴定和进化分析,并通过Real-time PCR方法检测了CaGRAS家族组织表达模式和对PEG6000、盐胁迫的应答。结果表明:在辣椒中存在54个CaGRAS基因,除11号染色体外其余染色体均有分布,外显子数1~3,等电点4.97~9.13;系统进化分析显示CaGRAS基因可分为8个进化群;CaGRAS基因具有不同的表达模式,在根、茎、叶片和茎尖中优势表达的基因分别有34、8、3和8个;多数CaGRAS基因能响应PEG6000和盐胁迫,其中CaGRAS11、CaGRAS30、CaGRAS40、CaGRAS44和CaGRAS50受到PEG6000和盐胁迫的强烈诱导。本研究为深入解析CaGRAS家族基因的功能奠定了一定基础。     

基于EST库的猕猴桃脂氧合酶基因家族成员的克隆

利用猕猴桃EST库及相关生物信息学手段, 从果肉组织克隆了LOX基因家族成员6个, 命名为AdLox1-6。AdLox1、AdLox2、AdLox3和AdLox4 为全长cDNA, 编码区长度分别为2 739、2 595、2 739 和 2 709 bp, AdLox5和AdLox6为cDNA片段, 长度为1 359和1 557 bp。猕猴桃AdLox2和AdLox5氨基酸序列同源性最高, 约74%, 而AdLox3 和AdLox5 仅为49%。生物信息学分析表明, AdLox1、AdLox3、AdLox4 和 AdLox6可能具有132LOX活性, 在N端含有额外约60个氨基酸残基, 而AdLox2和AdLox5则属于92LOX类型。猕猴AdLox1与番茄TomLoxD具有最高氨基酸序列同源性(约80%) , AdLox2和AdLox5与TomLoxA高度聚类, 序列同源性分别为68%和75%, AdLox4和AdLox6与TomLoxC的氨基酸序列同源性分别为62%和63%, AdLox3与番茄LOX基因序列同源性低于55%。