梨BAHD家族基因的鉴定及石细胞分化相关成员的筛选

[目的]在全基因组水平鉴定梨酰基辅酶A依赖型酰基转移酶(BAHD)家族基因,系统分析其在果实发育过程中的生物学功能,并筛选出与梨果实石细胞分化相关的BAHD家族成员.[方法]以Pfam转移酶家族蛋白质结构模型(PF02458)和模式植物HCT基因为参考,通过BAHD家族的保守基序HXXXD和DFGWG来鉴定梨BAHD家族基因,并结合梨果实不同发育时期和粗皮果转录组数据初步筛选BAHD家族中与石细胞分化相关的成员.[结果]从梨(Pyrus bretschneideri'Dangshansu')基因组中共筛选得到了 92个转移酶基因,其中的81个基因含有BAHD家族保守基序.这81个基因不均匀地分布在梨的15条染色体上,其中14个基因在基因组上有串联关系,15个基因有共线性关系.通过分析梨果实石细胞分化关键时期与粗皮果转录表达谱发现,19个BAHD家族基因在库尔勒香梨果实中表达丰度较高,且在石细胞分化时期及粗皮果中差异性表达,分别为木质素(4个基因)、香豆素(1个基因)、表皮蜡(1个基因)、木栓质(6个基因)和叶绿性挥发物(2个基因)合成酶相关基因,及油菜素内酯(3个基因)和黄酮类(1个基因)修饰相关酶编码基因以及1个功能未知基因.[结论]部分BAHD家族成员在库尔勒香梨果实发育过程中可能参与木质素、香豆素、表皮蜡及木栓质的生物合成,同时还参与黄酮类及挥发性物质的修饰过程.     

苹果LysM类受体激酶基因家族鉴定与表达分析

以LysM(PF01476)和Pkinase(PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,在全基因组范围比对分析了苹果(Malus×domestica Borkh.)LysM-RLK家族的成员,对其家族成员的理化性质、进化关系、染色体分布、基因结构等进行了分析;基于已公布的转录组学数据,分析了LysM-RLK基因在苹果组织、发育过程和生物胁迫中的表达情况。通过分析,共获得12个苹果LysM-RLK基因,其氨基酸序列大小介于553~1 053,分子量介于62.65~119.04 kD,等电点介于5.11~7.45,主要位于质膜;根据进化分析将其分为3个亚组,亚组内各成员的外显子—内含子结构呈现较为相似的特征。基因表达数据显示,苹果的4个LysM-RLK基因表达存在较大的组织特异性,7个基因在苹果腐烂病和再植病发病过程中为差异表达。     

苹果L-LEC-RLK基因家族鉴定及响应病原真菌信号的表达分析

以L型类凝集素(Lectin-LegB;Pfam:PF00139)和激酶(Pkinase;Pfam:PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,鉴定了苹果(Malus×domestica Borkh.)L型类凝集素类受体激酶(L-LectinReceptor-like kinase,L-LEC-RLK)家族成员,并对其理化性状、进化特征、亚细胞定位、染色体位置和表达模式进行分析。通过鉴定,共获得41个成员,其氨基酸序列大小介于423～1 291 aa,分子量介于47.12～143.27 kD,等电点介于5.50～8.91,其中28个成员位于质膜。根据进化分析将拟南芥、水稻、马铃薯、杨树和苹果等5个物种的L-LEC-RLKs分为8个亚组,苹果L-LEC-RLKs分布于亚组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ。染色体位置分析表明苹果L-LEC-RLKs存在多个串联重复。该家族成员在不同组织中存在多样化的表达模式。27个成员在苹果接种腐烂病菌(Valsa mali,Vm)或斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype,AAAP)后存在差异表达。其中,MD15G1226500和MD14G1055200的表达量在两种病害发生后都发生了显著的差异。以上差异基因可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。     

桃MRLK家族全基因组鉴定及蚜虫侵染后的表达分析

以Malectin（PF11721）、Malectin-like（PF12819）和Pkinase（PF07714）保守域全蛋白序列为种子序列，鉴定桃（Prunus persica）基因组中全部MRLK类受体激酶（Malectin receptor-like kinases）家族成员，并利用转录组测序分析桃绿蚜侵染不同时间MRLK在抗蚜和感蚜品系材料中的表达情况。利用生物信息学手段进行分析，共获得41个MRLK家族成员，这些基因分布在桃的8条染色体上。家族成员氨基酸数量介于391 ~ 1 035 aa，分子量44.05 ~ 115.09 kD，等电点5.38 ~ 9.16。分析系统进化树发现拟南芥、水稻和桃的MRLK家族分为5个亚组，其中桃MRLK家族成员分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚组上。亚细胞定位预测显示该家族成员全部定位在细胞膜上。顺式作用元件预测结果显示该家族成员启动子包含光、激素以及响应生物与非生物胁迫的作用元件。桃绿蚜侵染结果表明，桃MRLK家族中19个基因在5个桃材料中均未表达，15个基因在抗蚜品系‘P5868’与其他4个材料之间无差异表达。PpMRLK2、PpMRLK9、PpMRLK22、PpMRLK23、PpMRLK24、PpMRLK26和PpMRLK32在抗蚜品系‘P5868’中表达量比其他品系高，其中PpMRLK26表达量差异显著。进一步分析发现，在抗蚜品系‘P5868’中表达的22个MRLK呈组成型表达，蚜虫侵染处理不会对基因的表达产生影响。综上，推测PpMRLK26可能调控抗蚜品系‘P5868’的抗蚜性状的形成。     

梨蔗糖合成相关酶SUS和SPS基因家族的鉴定与表达分析

运用生物信息学方法,对梨蔗糖合酶（SUS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因进行全基因组鉴定与基因结构、系统发育关系、蛋白质保守功能域、染色体定位和基因进化模式分析,利用转录组数据和实时荧光定量PCR技术分析低蔗糖型‘砀山酥梨’和高蔗糖型‘翠冠’果实发育过程中SUS和SPS家族基因的表达模式。结果表明,梨中包含17个SUS基因（PbrSUS1 ~ PbrSUS17）和8个SPS基因（PbrSPS1 ~ PbrSPS8）;SUS基因家族分为3个亚家族,分别为SUS1、SUSA和SUS2。梨SUS和SPS基因家族成员不均匀地分布在10条染色体上,主要通过片段复制事件进行扩张,且在进化过程中主要受纯化选择作用。PbrSPS3、PbrSPS4、PbrSPS8、PbrSUS2和PbrSUS15是调控梨果实蔗糖合成积累的重要基因。     

苹果CR4基因家族鉴定与表达分析

以RCC1（PF00415）、TNFR_c6（PF00020）和Pkinase（PF00069）保守域全蛋白序列为种子序列,在苹果全基因组范围比对分析了CRINKLY4（CR4）家族成员,对其理化性质、进化关系、染色体分布等进行了分析;基于qPCR分析了CR4基因在苹果腐烂病发生和低温胁迫过程中的表达情况。通过分析,共获得8个苹果CR4基因,其氨基酸序列大小介于668 ~ 1 690,分子量介于71.73 ~ 187.61 kD,等电点介于5.69 ~ 8.66,主要位于质膜;根据进化分析将其分为两个亚组。PCR表达分析结果表明,CR4基因在苹果不同组织和品种间存在不同的表达模式。分别有8个和6个CR4基因在苹果花芽感受低温和接种腐烂病菌后至少在1个时间点发生差异表达。其中,MD03G1068800在花芽感受低温后上调达25倍以上,而MD00G1166500和MD01G1153100在腐烂病发生后上调达150倍以上,以上3个CR4基因可作为后续功能研究的候选基因。     

苹果miR396家族鉴定及在不定根发育过程中的表达分析

分析了苹果miR396家族进化特性及其在苹果不定根发育过程中的表达模式。结果表明：苹果miR396家族有4条成熟体和7条前体序列（pre-miRNA）。Mfold预测显示Pre-miR396家族7个成员序列均可形成典型稳定的茎环二级结构,最小折叠自由能介于–62.9 kal ? mol-1（pre-miR396b）~–51.9 kal ? mol-1（pre-miR396g）之间。系统发育进化树分析显示,pre-miR396家族亲缘关系可分为3个亚组（G1、G2、G3）,每个亚组内基因数量不同,分别含有11、9、19个。靶基因预测显示,苹果miR396靶基因包括MdGRF1、MdGRF2和MdGRF5等,降解组测序进一步验证了miR396对其候选靶基因MdGRF1、MdGRF2和MdGRF5的剪切关系。苹果miR396家族成员在侧根和果实中的表达量显著高于其他组织,其候选靶基因表达量则在花芽和腋芽中显著高于其他组织;不定根发育过程中,miR396家族不同成员表达模式存在显著差异,整体上呈上调表达趋势,其候选靶基因呈下调表达趋势;外源IBA处理显著诱导miR396家族成员的表达,尤其是在不定根诱导期和根系生长期更为显著。     

丹参DHAR家族基因的鉴定及表达模式分析

运用生物信息学方法,从丹参（Salvia miltiorrhiza）基因组数据库中鉴定得到5个脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate reductase,DHAR）家族成员SmDHAR1 ~ SmDHAR5,分析了基因结构特征、编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、高级结构、系统进化关系以及启动子顺式作用元件,并考察了其在不同组织及胁迫下的表达模式。结果表明,SmDHAR基因家族成员长度在724 ~ 3 296 bp之间,含有1 ~ 5个外显子不等,编码218 ~ 470个氨基酸;其编码蛋白多为亲水性蛋白,且多不含跨膜结构域。SmDHAR家族成员分布在叶绿体和胞质外。系统进化分析结果显示丹参SmDHAR基因分为2个亚类。上游启动子区域分析发现SmDHAR基因家族成员均含有与植物发育、激素及胁迫响应相关的顺式作用元件。表达模式分析结果显示,SmDHAR5在丹参根中显著高表达,而在其余组织中表达量较低;SmDHAR1、SmDHAR3与SmDHAR4在根、茎、叶中表达量较高,在花组织中表达最低;SmDHAR2表现为组成型高表达。SmDHAR在茉莉酸甲酯、酵母提取物、脱落酸、赤霉素、水杨酸等处理时也表现出不同的响应模式。本研究的结果为深入探索丹参DHAR基因家族在抵抗逆境过程中的功能提供了参考。     

植物Gly-RLK基因家族鉴定及其在苹果中的表达分析

类受体激酶（receptor like kinase，RLK）在植物生长发育和环境适应中起重要作用。前期研究发现苹果（Malus  domestica）中存在一类具有Glyco_18胞外结构域（SM000636或SM000704）的RLK，命名为Glyco_18-RLK（Gly-RLK）。本试验中以Glyco_18和Pkinase（SM000220）保守域全蛋白序列为种子序列，对53种被子植物基因组中的Gly-RLK进行鉴定，并分析其进化特征；明确苹果Gly-RLK（MdGly-RLK）的理化性状、亚细胞定位，基因在染色体上的分布、启动子区域的顺式作用元件和表达模式。结果表明，仅19种植物中存在Gly-RLK，家族成员数介于1 ~ 20，单子叶植物中均未发现该家族成员。根据进化分析将其分为8个亚组，亚组Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ分布基因数较多。共发现6个MdGly-RLK，其编码的氨基酸序列大小、分子量和等电点分别介于451 ~ 776、50.99 ~ 87.33 kD和5.95 ~ 8.21，主要位于质膜，4个为串联重复。MdGly-RLK在苹果各组织和品种间存在不同的表达模式；接种苹果腐烂病菌（Valsa mali）后，6个MdGly-RLK均差异表达，MdGly-RLK6（MD15G1156900）可上调至对照的16.33倍。综上，Gly-RLK仅在部分双子叶植物中存在，家族成员的扩增速度较快。MdGly-RLK响应苹果生长发育和黑腐皮壳菌信号，MdGly-RLK6可作为苹果抗腐烂病研究的候选基因。     

杜梨NHX基因家族的鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

【目的】NHX基因亚家族为钠氢逆转运体,具有Na+/H+exchange(PF00999)蛋白结构域,广泛存在于多种物种中,主要参与植物响应盐胁迫过程离子平衡的重建。分析鉴定杜梨中NHX基因及其耐盐机制有助于实际生产中更为有效地利用这一砧木资源。【方法】结合已公布的梨基因组数据以及拟南芥相关数据,通过生物信息学手段,鉴定杜梨NHX基因家族成员;通过MEGA7.0软件进行序列比对以及进化分析;通过在线工具Pfam、SMART以及GSDS进行基因结构分析;通过定量PCR技术分析非生物胁迫下基因在不同组织中的表达特征;应用火焰石墨炉原子吸收光谱仪测定NaCl胁迫下杜梨不同组织中Na+与K+含量。【结果】成功鉴定出16个候选基因,其中有4个基因属于NHX亚家族,4个基因属于CHX亚家族,8个基因属于KEA亚家族。预测的候选基因均含有Na+/H+exchange功能域;NaCl胁迫下,预测的16个基因在叶片中的表达差异大,但在8 h以后均为负调控;在茎中,PEG6000处理下,PbNHX1的表达量显著增高,且高于同一时期NaCl胁迫下的表达水平,仅在48 h时低于同一时期NaCl胁迫下的表达水平;在根中,基因PbNHX12、PbNHX13、PbNHX14和PbNHX15在NaCl胁迫和PEG6000处理下在任何时间段均为负调控。【结论】在盐胁迫过程中,与拟南芥NHX基因进化关系最近的PbNHX1和PbNHX11呈现出负调控模式,与拟南芥KEA基因进化关系相近的PbNHX10和PbNHX7可能参与K+的运输。     

梨种质资源对腐烂病抗性的室内评价

采用离体枝条分生孢子悬浮液和菌丝块接种测定了11 种梨种质资源共211 份材料对腐烂病的抗性。结果显示：不同种质资源对病菌的侵入和扩展的抵抗均存在差异,抗侵入的占17.5%,抗扩展的占35.1%;同一种质资源对病菌侵入与扩展的抵抗之间也有差异,对病菌侵入和扩展抵抗一致的占30.3%,不一致的占69.7%;所有供试材料中对病菌侵入和扩展均为高抗（HR/HR）的占1.4%,抗病（R/R）的占4.7%,中等（M/M）的占12.3%,感病（S/S）的占10.9%,高感（HS/HS）的占0.9%;通过综合抗性评价发现,‘大香水’、‘杜梨’、‘江岛’、‘康德’、‘龙泉酥’、‘苹果梨’、‘山梨’、‘云红1 号’、‘早玉’和‘长十郎’为抗病（R/R）材料,‘新高’、‘武豆9 号’和‘荆杜3 号’为高抗（HR/HR）材料,‘新星’和‘新黄’为高感（HS/HS）材料。     

梨Ty1-copia类反转录转座子GAG开放阅读框预测和光响应下的表达分析

基于生物信息学方法,对‘砀山酥梨’基因组中Ty1-copia类型的GAG开放阅读框进行预测,共获得315条GAG序列。通过系统聚类,梨基因组中GAG序列可分为7个支系,第一和第三支系成员较多且保守性高。序列比对结果显示,不同支系GAG序列具有较高的异质性。在‘美人酥’梨的套袋和摘袋后的果皮中发现了34个gag成员,其中有6个（Ppgag16、Ppgag19、Ppgag23、Ppgag27、Ppgag29和Ppgag30）为高丰度表达成员。遮光条件下,‘美人酥’果皮中有部分gag成员发生表达,说明copia类反转座子不仅仅受光照影响发生表达。在摘袋后,‘美人酥’果皮中有2个成员（Ppgag5和Ppgag23）发生明显上调表达,说明梨中部分反转录转座子的转录受到光照的调控。     

库尔勒香梨kfpMYB及其启动子的克隆和对激素的应答反应

为明确库尔勒香梨萼片脱落和宿存与kfpMYB基因表达的关系,以其花器官为材料,根据库尔勒香梨kfpMYB基因cDNA序列及梨基因组信息设计引物,通过PCR获得了该基因长度为1 659 bp的基因组DNA序列和2 440 bp的上游调控序列,利用PLACE和PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件的预测分析。生物信息学分析表明,kfpMYB启动子序列中存在一些与激素调节相关的元件,如脱落酸响应顺式作用元件ABRERATCAL、DPBFCOREDCDC3和EBOXBNNAPA,赤霉素信号抑制因子WRKY71OS、GARE-motif和TATC-box,生长素诱导有关元件NTBBF1ARROLB和TGA-element。利用实时荧光定量PCR检测了不同生长调节物质处理对kfpMYB转录水平的影响,实时荧光定量PCR分析结果表明ABA、ETH、GA、NAA和果树促控剂（PBO）对kfpMYB的表达均有不同程度的影响,说明这些调控元件参与了基因的表达。     

梨品种果肉石细胞含量比较研究

对保存于“国家果树种质兴城梨、苹果圃”的5个梨主要栽培种304个品种的果肉石细胞含量进行了测定分析,包括白梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）品种117个、砂梨〔P. pyrifolia （Burm.f.） Nakai〕89个、秋子梨（P. ussuriensis Maxim.）35个、新疆梨（P. sinkiangensis Yü）8个、西洋梨（P. communis L.）16个以及种间杂交品种39个。结果表明：梨栽培品种每百克果肉石细胞含量平均值为0.684 g, 范围为0.010 ~ 6.678 g,其中主要栽培种白梨、西洋梨、砂梨和秋子梨品种分别为0.462、0.524、0.552和1.887 g,变化范围分别是0.020 ~ 1.479、0.027 ~ 1.136、0.010 ~ 2.018和0.256 ~ 6.678 g。秋子梨品种果肉石细胞含量总体最高,白梨最低。通过3年鉴定,筛选出早酥、德胜香、赤穗、玛丽娅、泗阳青梨、康佛伦斯、巴梨、青魁等8个石细胞含量极低的品种。     

砂梨山梨醇转运蛋白(SOT)基因家族成员表达特性及在果实糖积累中的作用初探

山梨醇转运蛋白(SOT)是植物山梨醇运输的关键载体。参考已公布的白梨基因组数据,应用RNA-seq技术在砂梨果肉中鉴别出22个有表达的山梨醇转运蛋白(SOT)基因家族成员,其中10个高表达成员的表达量之和占总表达量的92%。q RT-PCR分析表明上述10个成员的表达存在明显的组织特异性,所有成员在种子中的表达丰度最低;Ppy SOT8在所有组织和器官中都有不同程度表达;Ppy SOT26仅在幼叶中有一定表达。在果实发育期间Ppy SOT2、Ppy SOT8、Ppy SOT10/28和Ppy SOT33的相对表达丰度与果实山梨醇积累呈现良好相关性。4℃贮藏期间果实山梨醇含量趋于下降,与Ppy SOT3、Ppy SOT4、Ppy SOT8、Ppy SOT25、Ppy SOT32和Ppy SOT33表达上调相关。     

梨品种果肉石细胞团大小对果肉质地的影响

 对白梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）、砂梨[P. pyrifolia（Burm.f.）Nakai]、秋子梨（P. ussuriensis Maxim.）、新疆梨（P. sinkiangensis Yü）、西洋梨（P. communis L.）以及种间杂交种,共319个品种的石细胞团大小进行分析。结果表明：直径大于250 μm的石细胞团约占供试品种总体石细胞团含量的75%以上;直径小于250 μm的石细胞团对感官评价果肉质地的影响较小,直径大于250 μm的石细胞团含量是影响果肉质地的重要指标。