单克隆抗体间接免疫荧光检测猪瘟病毒方法的建立

以作者制备的抗猪瘟病毒单克隆抗体(anti-CSFV McAb)为一抗、荧光素标记羊抗小鼠IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立检测猪瘟病毒抗原的间接免疫荧光(IFA)检测方法。确定IFA最佳工作条件:CSFV最佳接种浓度和培养条件为CSFV 10-3倍稀释后接种PK15细胞,37℃5%CO2恒温箱中培养36 h;McAb最适工作浓度为1∶1 000倍稀释;荧光素标记的羊抗小鼠IgG荧光抗体的最适工作浓度为1∶50倍稀释。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法检测CSFV感染PK15细胞为阳性,而检测伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)感染PK15细胞均为阴性。结果表明,建立的检测细胞培养中CSFV抗原的IFA检测方法具有敏感特异、简便快速等优点,可用于CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布研究。     

用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究

为用体外试验方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力,以猪瘟病毒抗体（兔源）为一抗、荧光素标记羊抗兔IgG 为二抗,建立了CSFV兔化弱毒株的间接免疫荧光检测方法（ IFA）。特异性试验表明,用该IFA方法检测CSFV兔化弱毒株接种的RK细胞为阳性,而检测伪狂犬病毒、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病毒接种的RK细胞均为阴性。 CSFV兔化弱毒株和活疫苗的兔体感染量（ RID）用兔体测定,半数组织感染量（ TCID50）用IFA测定,拟合RID与TCID50的线性回归方程,确定1RID/mL＝（ TCID50/0．1mL＋200）/12。     

PCV-2分离新方法的建立及广东株全基因序列的分析

利用体外环化的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因的感染性,建立一种分离PCV-2的方法。根据GenBank中PCV-2的基因序列,设计合成1对扩增PCV-2全基因组的特异性引物。通过PCR方法从广东发病猪病料扩增到PCV-2全基因组片段,将该片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得阳性重组质粒pM-DT-YF并测序。将所测序列与GenBank中发表的PCV毒株序列进行同源性比较。将质粒pMDT-YF大量扩增,经SacⅡ酶切质粒得到PCV-2全基因组,通过T4连接酶体外环化后,脂质体介导转染PK-15细胞,盲传8代。用间接免疫荧光抗体试验(IFA)可检测到特异性荧光。将转染细胞稀释后接96孔细胞培养板,培养3 d。用荧光定量法检测各孔的PCV-2拷贝数,选择拷贝数最大的细胞扩大培养,经IFA法测定病毒滴度显著增加。结果表明,利用具有感染性的体外环化的全基因组的克隆转染PK-15细胞,并通过选择压力可获得较高滴度的具有感染性的PCV-2。     

猪瘟病毒荧光定量PCR的建立及对病毒体外复制动态的研究

为了了解猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞上的增殖规律。根据GenBank中CSFV Shimen毒株的NS5A基因保守区域序列,设计1对特异性引物,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立了基于实时荧光定量PCR技术的CSFV检测方法,并对其进行了敏感性、特异性、重复性试验,结果显示,该方法重复性好、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID_(50 )/mL。利用所建立的方法研究CSFV在PK-15细胞上清中的增殖动态,并与TCID_(50)方法绘制的复制动态曲线进行比较。结果显示,两种方法测定的CSFV在PK-15细胞上的复制动态具有一定的平行关系,该方法为研究猪瘟病毒的致病机理及利用体外细胞培养毒生产疫苗提供了试验依据。     

猪瘟病毒GZA株的分离鉴定及遗传变异分析

本研究收集贵州规模化猪场猪瘟净化过程中RT-PCR检测阳性病料,采用细胞接毒技术、病毒的形态结构观察和间接免疫荧光试验等分离鉴定了1株猪瘟病毒(CSFV),命名为CSFV GZA株,并对GZA株E2基因的核苷酸和氨基酸序列进行差异性分析。分离鉴定结果表明:接种PK-15细胞后连传7代RT-PCR均能扩增出CSFV特异性条带;病毒粒子在电镜下呈椭圆形或圆形,直径30～80nm;该毒株E2基因与参考毒株E2基因的核苷酸同源性82.8%～83.4%,氨基酸相似度88.7%～90.6%,并在713,725,729,734,738氨基酸位点发生改变;遗传进化树分析还得出GZA株E2基因与参考毒株遗传距离较远。说明本次分离株与其他流行株存在一定的差异,可为以后CSFV病原学的研究提供参考。     

猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组克隆和序列分析

通过PCR方法对采自四川省某规模化猪场一批疑似断奶仔猪多系统衰弱综合征病例的肺脏、淋巴结进行PCV-2的抗原检测,并将检测结果为阳性的对应组织研磨、过滤除菌后接种无PCV-1污染的PK-15细胞,盲传15代后,IFA方法检测出有明显的特异性荧光,将该毒株命名为PCV-2-SC株,并对PCV-2-SC病毒基因组全长进行扩增及克隆、测序与比对分析。测序结果显示该病毒基因组全长1 767bp,分离株与国内外参考毒株核苷酸序列相似性在95.2%～99.5%之间,进化树分析表明,PCV-2分离毒株在进化上存在地域相关性。PCV-2四川株的分离鉴定为其诊断试剂的研制及检测方法的建立奠定了基础。     

猪瘟病毒单克隆抗体制备及病毒荧光检测研究

应用纯化的猪瘟病毒疫苗免疫Balb/c小鼠,以重组的E2和E0蛋白为检测抗原,筛选制备了17株抗猪瘟病毒的杂交瘤细胞株。用猪瘟病毒石门毒接种PK-15细胞,以制备的17株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验,结果显示有7株单抗呈现良好特异性荧光染色。     

猪源含缬酪肽蛋白(VCP)的真核表达及其活性鉴定

含缬酪肽蛋白(VCP)作为细胞中的重要活性蛋白,参与多种细胞过程,也在许多病毒的感染过程中发挥重要作用。为了探究VCP对猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV)和伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,试验扩增了猪源VCP的基因片段,并将其连接到pEGFP-C1载体中。经双酶切鉴定结合基因测序结果,成功构建真核表达重组载体pEGFP-VCP。通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)证实,重组质粒EGFP-VCP能在猪肾细胞(PK-15)中成功表达。而在表达pEGFP-VCP的细胞中分别感染CSFV、JEV和PRV后,通过Western blot、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、半数细胞感染量(TCID₅₀)以及IFA试验,检测到过表达VCP能够明显促进CSFV、JEV以及PRV病毒蛋白的表达,提高胞内病毒核酸的含量,并且使胞外病毒滴度增加,极大地促进了3种病毒在PK-15细胞中的复制,为深入研究VCP促进多种病毒感染宿主细胞的分子机制奠定了理论基础。     

"猪高热病"的流行病学调查与主要病因分析

按浙江省出现"猪高热病"流行高峰前后两个时段,采集了53个养猪场户的病猪组织病料和114份病猪及健康猪血清样品,应用PCR或RT-PCR同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)等7种病毒,应用ELISA方法检测PRRSV、PCV-2、PRV(gE)三种抗体。高热病病猪的病毒检测结果表明,疫情发生前对病猪检测7种病毒性病原,检到PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV和PPV共5种病毒,检出率分别为24%、32%、34%、1.5%和0.5%,与发生疫情后的检出率比较,只有PRRSV的病毒检出率呈明显上升,从24%上升到57.7%,PCV-2病毒检出率基本持平,CSFV、PRV和PPV病毒检出率则出现下降或未检到,且流行高峰出现前后均未检到SIV和JEV。抗体检测结果显示,疫情发生后发病猪群的PRRS抗体上升最为显著,从8.97%上升到80.6%,PCV-2抗体从16.7%上升到27.8%,PR(gE)抗体下降为0,提示此次疫病是以PRRS为主要病原或诱因所致的多病原综合性传染病。     

血红素加氧酶1对猪瘟病毒复制的影响

本实验研究了猪血红素加氧酶1对猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞中复制的影响,本研究应用siRNA干扰方法抑制PK-15细胞中血红素加氧酶1表达后再接种CSFV,细胞中CSFV基因组增殖与对照组相比显著下降;感染病毒细胞中和培养上清中CSFV滴度也显著降低。本实验首次报道了干扰细胞中HO-1表达对CSFV细胞中增殖的影响,提出了CSFV与血红素加氧酶1新的相互作用关系。     

细胞亲环蛋白A对猪瘟病毒增殖的影响

细胞亲环蛋白A(CyPA)在多种病毒感染中起重要的调控作用。本实验室前期蛋白质组学研究表明,猪瘟病毒(CSFV)感染PK-15后细胞的CyPA明显上调表达。为研究CyPA在CSFV增殖中的作用,本研究首先采用环孢素A(CsA)处理PK-15细胞,特异性地抑制CyPA顺反异构酶活性,观察对CSFV的影响,在CsA处理后24 h、48 h、72 h收集细胞和细胞冻融上清,进行病毒基因组拷贝数和病毒滴度测定。结果表明CsA处理能够抑制CSFV在PK-15细胞中的增殖。同时,采用RNA干扰方法,下调PK-15细胞中CyPA的表达,结果也能够抑制CSFV在细胞中的增殖。本研究结果证明CyPA对CSFV在PK-15细胞中的增殖具有调控作用,对进一步阐明CSFV与宿主细胞蛋白的相互作用具有重要意义。     

猪瘟病毒E2蛋白配体表位的筛选与鉴定

为进一步精确定位猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白配体表位信息,利用DNASIS(Ver.2.5)软件分析设计合成7条多肽,主要覆盖E2蛋白,分别命名为SE21、SE22、SE231、SE232、SE241、SE242、SE03,同时设计合成1条无关多肽CP,均标记FITC。将PK-15细胞作为靶细胞,通过多肽与PK-15细胞结合试验、多肽抑制CSFV感染PK-15细胞试验和CSFV阻断多肽与PK-15细胞结合试验,筛选和鉴定E2蛋白配体表位。结果表明,多肽SE241、SE242与PK-15细胞结合的平均荧光强度分别为74.43±4.59和83.60±3.11,显著高于其他多肽,抑制CSFV感染PK-15细胞的感染抑制率也显著高于其他多肽,同时这2条多肽与PK-15细胞的结合被CSFV有效阻断。证实SE241、SE242多肽为CSFV与靶细胞PK-15细胞结合的配体表位,并能抑制CSFV感染PK-15细胞。本试验为CSFV新型多肽疫苗或免疫佐剂的研制提供依据。     

猪圆环病毒感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征

1974年 ,德国学者 Tischer等 [1 ] 从 PK- 15 (ATCCCCL31)细胞的污染病毒中检出一种形态学上与细小核糖核酸病毒相似的小球形病毒和乳多泡病毒样病毒粒子 ,并于1982年将其命名为猪圆环病毒 (porcine circovirus,PCV) [2 ] 。目前已知 PCV有 PCV- 1和 PCV- 2 2个血清型。PCV- 1来源于 PK- 15细胞 ,为非致病性 PCV(nonpathogenic PCV,np PCV ) [3 ] ;PCV- 2与断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning m ultisystem ic wasting syndrom e,PMWS)密切相关 ,又称 PMWS相关 PCV[3 ] (PMWS- associated PCV,pmws- PCV)。 PM…     

2017—2021年南阳市猪主要病毒病的病原学检测与分析

为了掌握2017—2021年南阳市猪主要病毒病的流行情况，试验应用RT-PCR/PCR方法对采集的261份临床病料样品进行猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV-2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3, PCV-3)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)5种病原的检测，并按不同地区、不同年份、不同季节及混合感染和单一感染情况进行统计分析。结果表明：南阳市存在CSFV、PRRSV、PCV-2、PCV-3和PRV的流行，以PCV-2的阳性率(24.52%)最高，PRV(9.96%)次之，CSFV和PRRSV的阳性率(3.45%和3.83%)较低。CSFV、PRRSV、PCV-2、PCV-3、PRV阳性率最高的地区分别为宛城区(6.90%)、镇平县(8.57%)、社旗县(3...     

猪圆环病毒-Ⅱ型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及初步应用

针对猪圆环病毒-Ⅱ型(porcine circovirus typeⅡ,PCV-Ⅱ)、猪瘟病毒(swine fever virus, CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的保守区域设计用于构建荧光定量PCR体系的引物和探针。以构建的重组质粒标准品为模板建立三重荧光定量PCR体系,并对三重荧光定量PCR体系进行优化和特异性检测、灵敏性检测、重复性试验、标准曲线制作。最后利用构建的三重荧光定量PCR体系和普通PCR体系同时进行临床检测,并对两者的检测结果进行对比。结果显示,3种病毒在单重和三重荧光定量PCR体系中均无非特异性扩增;3种病毒在单重和三重荧光定量PCR体系中的灵敏度均可达到10拷贝/μL;单重和三重荧光定量PCR体系组内和组间重复性变异系数均在5%以内;单重和三重荧光定量PCR在稀释度范围内呈现良好的线性关系。应用本研究构建的三重荧光定量PCR体系对106份临床组织样品进行检测,其中PCV-Ⅱ阳性检出率为74.5%,CSFV阳性检出率为34.9%,PRRSV阳性...     

猪瘟疫苗在猪圆环病毒2型阳性猪场的免疫效果观察

为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对猪瘟疫苗免疫效力的影响,对PCR证实为PCV-2阳性的试验猪进行猪瘟疫苗的免疫,分别在免疫后第1、3、7、14、21、28和63天对试验猪进行猪瘟病毒(CSFV)和PCV-2的抗体检测。检测结果表明PCV-2阳性猪在猪瘟疫苗免疫后均未能产生有效的CSFV抗体,从免疫猪的血液和内脏组织中也未能检测到CSFV核酸。虽然只能从1头PCV-2阳性猪的血清中检测到PCV-2抗体,但是却能从全部实验猪的淋巴结中检测到PCV-2的核酸。试验猪的病理组织学观察和白细胞计数也表明PCV-2阳性猪的淋巴结呈典型的PCV-2感染的病理变化,且白细胞数量显著低于健康猪。表明PCV-2的感染会对猪的免疫系统造成损害从而抑制猪瘟疫苗的免疫效果。     

古典猪瘟病毒LOM株感染性cDNA克隆的构建及其生物学特性

古典猪瘟病毒(CSFV)引起猪的高度传染性疾病,严重影响全球经济。古典猪瘟病毒LOM株是由1956年从日本宫城分离的低毒株致弱而成。本研究通过RT-PCR获得LOM株基因组的8个DNA片段,用于确定其全基因序列并构建全长cDNA克隆(Flc-LOM)。序列分析结果表明,与亲本序列相比,重组克隆Flc-LOM有8个位点突变,导致2个氨基酸替换。LOM和Flc-LOM的RNA转录本直接感染PK-15细胞,与亲本病毒LOM株相比,拯救的Flc-LOM病毒在细胞中生长缓慢。肌肉注射Flc-LOM安全,且在猪体内有高度的免疫原性,观察35d,无临床症状,无病毒传染给其他动物。接种后14d可检测到猪瘟病毒特异性中和抗体。在CSFV强毒株SW03攻毒后,接种Flc-LOM的猪获得了完全保护。因此,本研究构建的CSFV感染性克隆Flc-LOM可作为猪瘟候选疫苗。     

异源CD151蛋白在H9c2细胞中的表达对PRRSV感染的影响

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由PRRS病毒（PRRS virus,PRRSV）引起的以猪繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性疾病。研究表明PRRSV可在表达CD151的一株鼠源细胞系中复制增殖,提示异源CD151可能与PRRSV复制增殖相关。为了进一步验证异源CD151本文运用是否参与病毒的复制增殖,本研究验证了表达CD151的大鼠来源的心肌细胞系H9c2对PRRSV的易感性。RT-PCR和间接免疫荧光分析（indirect immunofluorescence analysis,IFA）表明H9c2细胞系中表达CD151蛋白和波形蛋白。病毒吸附试验和攻毒试验提示该病毒可以与H9c2细胞结合,但接种病毒后细胞培养上清和细胞裂解液中均不能检测到病毒核衣壳N蛋白表达,表明病毒不能在该细胞中复制。这一结果提示H9c2细胞中表达的异源CD151不能支持PRRSV的复制增殖。     

规模化猪场PRRSV不同感染状态下防控实践探讨

本文针对猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)不同感染状态,通过不同防控措施(接种疫苗、药物保健和生产组织优化),探讨了猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的防控经验。试验结果：PRRSV阳性不稳定猪群,接种PRRS灭活疫苗连续2次,1个月可实现猪群抗原阴性,阴性维持时间大约100d;PRRSV阴性猪群采用PRRS弱毒活疫苗半数低剂量免疫,排毒时间约28 d,免疫猪群100%转阳,而未免疫猪转阳率为30%～40%。     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。