光照对荔枝果实着色和花色素苷生物合成影响的分子机制研究

以‘桂味’荔枝为试材,花后45 d用双层牛皮纸对整个果穗进行完全遮光处理,14 d后(采收前7 d)解除遮光,比较遮光和解除遮光处理果皮着色以及花色素苷生物合成途径中LcUFGT等8个结构基因和调控基因LcMYB表达的变化,探索光照调控荔枝果实花色素苷合成和着色的分子机制。研究发现:遮光处理显著抑制了果皮花色素苷的合成,延缓了果实的正常着色;解除遮光后,花色素苷迅速合成,7 d后呈现荔枝典型的红色;遮光处理抑制了花色素苷生物合成途径中LcUFGT等8个重要结构基因和调控基因LcMYB1的正常表达;解除遮光后LcUFGT和LcMYB1等基因的表达量均有不同程度的增加,其中LcDFR、LcF3'H、LcUFGT和LcMYB1的表达与花色素苷含量的变化规律基本一致。可见,荔枝果皮花色素苷积累和着色依赖光照,花色素苷生物合成途径中主要的结构基因和转录因子都可以被光诱导,其中LcDFR、LcF3'H、LcUFGT和LcMYB1可能在光照调控荔枝果实色泽形成中扮演更为重要的角色。     

钩藤毛状根的诱导及其钩藤碱含量的测定

为建立钩藤毛状根的培养体系,以钩藤组培无菌苗为试材,利用发根农杆菌A4、ATCC15834、R16011侵染钩藤外植体,探讨了不同钩藤外植体、菌液浓度、AS浓度、干燥处理时间对毛状根诱导率的影响。结果表明:以钩藤叶片作为外植体,预培养3 d,以OD600=0.6的A4菌株浸泡30 min后,干燥处理1 h,转入含100μmol·L-1乙酰丁香酮无激素WPM培养基中共培养3 d,在含600 mg·L-1头孢克肟筛选培养基上能获得较高的毛状根诱导率,毛状根诱导率达53.66%。PCR扩增鉴定表明,钩藤细胞核基因组中已成功整合发根农杆菌的发根基因。钩藤毛状根在无激素1/2MS液体培养基中培养20 d后,部分毛状根中钩藤碱含量明显提高,最高含量是带钩枝条中的2.06倍,达1.211 mg·g-1。     

贴梗海棠花青苷组成及其与花色的关系

 以贴梗海棠[Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai]不同花色的24份种质为材料,调查了其花色在CIE L*a*b*表色系的分布状况,利用高效液相色谱—光电二极管阵列检测（HPLC–DAD）和高效液相色谱—电喷雾离子化—多级质谱联用技术（HPLC–ESI–MSn）定性定量分析其花青苷组分,运用多元线性回归方法分析了花色与花青苷组成之间的关系。结果表明,贴梗海棠花瓣中共含有6种花青苷,分别是矢车菊素–3–O–半乳糖苷（Cy3Ga）、矢车菊素–3–O–葡萄糖苷、天竺葵素–3–O–半乳糖苷、天竺葵素–3–O–（半乳糖葡萄糖苷）[Pg3（Ga-G）]、矢车菊素–3–O–（半乳糖葡萄糖苷）以及矢车菊素–3–O–琥珀酸–阿拉伯糖苷（Cy3SucAra）。Cy3SucAra为首次发现。其中,Cy3Ga、Pg3（Ga-G）和Cy3SucAra是决定贴梗海棠花色的主要色素,这3种色素含量的增加导致花色显著变红。基于花青苷的组成信息,探讨了贴梗海棠的花色改良和蓝色花创制的策略。     

紫外光对‘北陆’越橘转色果花青苷积累、关键酶活性及其基因表达的影响

以3年生‘北陆’越橘为试材,对发育过程中果实花青苷含量及合成酶活性变化进行研究,并进一步利用3种紫外光（UV-A、UV-B、UV-C）分别照射转色期越橘果实,测定了果实中花青苷等酚类物质的含量、生物合成酶活性及其基因表达,从底物、酶活性、基因转录水平阐明了不同紫外光对花青苷生物合成途径的影响。3种紫外光都明显诱导了果实花青苷的积累,特别是UV-C照射后果实花青苷含量提高了2.36倍。UV照射显著诱导果实PAL、UFGT酶活性升高,VcPAL、VcUFGT转录增强,但同时也抑制了DFR酶活性及基因表达,其中PAL、UFGT酶活性与花青苷的积累极显著正相关（r = 0.807**,r = 0.894**）,而DFR酶则相反（r =–0.854**）。结果表明,UV照射能诱导丙苯氨酸途径中响应紫外处理的一些关键基因的转录激活（如VcPAL,VcUFGT）或抑制（如VcDFR）,并影响相应酶活性的变化,促使花青苷等酚类物质的积累。     

越橘叶片秋季变色期间花青苷和叶绿素的变化特性

以4年生‘北陆’越橘为试材,对秋季叶色变化期间花青苷和叶绿素的含量和组分进行了研究。结果表明,随着叶色变化,花青苷总量升高,越到后期增幅越大,叶绿素总量下降,初期降幅较大;全绿叶片中解析出5种花青苷组分,随叶色变化组分增多,全红叶片中解析出11种组分,分别属于飞燕草素、牵牛花素、锦葵色素和矢车菊素;飞燕草素–3–O–阿拉伯糖苷、牵牛花素–3–O–葡萄糖苷和牵牛花素–3–O–半乳糖苷是主要的花青苷组分,共同主导了花青苷总量的变化趋势;飞燕草素和牵牛花素总量随叶色变化增加,但比值不变;叶绿素a与叶绿素b变化趋势一致,但叶绿素a含量较高,变化幅度较大。综合分析认为,花青苷积累量的增加和叶绿素积累量的减少是叶片变色的关键因素;飞燕草素与牵牛花素是主要的两类花青素,其含量和配比可能决定了叶片的红色;‘北陆’叶色变化过程中主要积累3种花青苷组分:飞燕草素–3–O–阿拉伯糖苷、牵牛花素–3–O–半乳糖苷和牵牛花素–3–O–葡萄糖苷,影响了花青苷总量及主要色素的配比,进一步影响了叶片颜色。     

恒山黄芪毛状根遗传转化体系的建立及活性成分含量测定

以恒山黄芪叶片为试材，采用发根农杆菌侵染诱导产生毛状根的方法，研究了不同菌株对恒山黄芪叶片诱导毛状根的能力和恒山黄芪毛状根的遗传转化体系，包括恒山黄芪不同外植体、菌液浓度、共培养时间、抗生素类型和浓度、乙酰丁香酮浓度对毛状根诱导率的影响，并测定规模培养的毛状根中总黄酮和总皂苷的含量，建立稳定的恒山黄芪毛状根体系，以期为进一步建立积累活性成分的恒山黄芪毛状根液体培养体系提供参考依据。结果表明：以OD₆₀₀=0.6的发根农杆菌LBA9402为菌种，侵染恒山黄芪叶片30 min,转入含100μmol·L^-1乙酰丁香酮1/2MS培养基中共培养3 d,在含500 mg·L^-1头孢克肟的筛选培养基上对于恒山黄芪叶的诱导能力最好，毛状根诱导率达54.1%,经PCR扩增鉴定，发根农杆菌LBA9402的发根基因整合到了恒山黄芪叶的基因组中。恒山黄芪毛状根在液体培养扩增后，总黄酮和总皂苷含量均明显提高，分别是自然根中含量的1.72倍和2.31倍。     

白东魁和东魁不同发育阶段果实花青苷组分及含量差异分析

白东魁是从东魁杨梅群体中发现的粉色果实变异株系,为研究东魁和白东魁果实色泽差异的形成机理,运用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术分析两个品种(系)果实不同发育阶段中果实花青苷种类和相对含量。结果表明,两个品种(系)成熟果实中均可以检测出7种花青苷,分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-O-鼠李糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3,5-O-二葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和芍药色素-3-O-葡萄糖苷;在幼果期和转色期,东魁和白东魁果实中均未检测出飞燕草素-3,5-O-二葡萄糖苷。白东魁成熟果实中除矢车菊素-3-O-鼠李糖苷外,其他6种花青苷含量均显著低于东魁;尤其杨梅果实中最主要的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷,白东魁果实中的含量只有东魁的13.93%,从而导致两个品种(系)成熟果实色泽的差异。     

发根农杆菌诱导毛酸浆毛状根条件的优化

以4种发根农杆菌A4、C58C1、R1601、ATCC15834为诱导菌株侵染毛酸浆叶片、茎段,研究了发根农杆菌种类、外植体类型、不同预培养时间、不同侵染时间、不同共培养时间和乙酰丁香酮对毛酸浆毛状根诱导率的影响,并用PCR检测rolB基因。结果表明:4种发根农杆菌均能诱导毛酸浆外植体产生毛状根,ATCC15834的诱导率相对较高,叶片优于茎段;最佳侵染时间为6~8min;预培养和共培养时间均为2~3d时诱导率较高;乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol·L~(-1)有利于促进毛状根的产生,经PCR检测证明,rolB基因已整合到毛酸浆毛状根基因组中。     

茉莉酸甲酯对地黄毛状根次生代谢的影响

以地黄毛状根为试材,茉莉酸甲酯作为诱导子,采用HPLC法测定梓醇与毛蕊花糖苷含量,采用紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷含量,研究了地黄毛状根在茉莉酸甲酯诱导下的次生代谢产物积累规律,以期提高地黄毛状根中有效成分的产量。结果表明:地黄毛状根中未能检测到梓醇;地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量在茉莉酸甲酯诱导后的第2天达到最大值,约为对照组的1.41倍。地黄毛状根中总环烯醚萜苷含量在茉莉酸甲酯诱导后变化不显著。在茉莉酸甲酯诱导初期,毛蕊花糖苷的合成显著增加,随着诱导时间的延长,较高的毛蕊花糖苷浓度也可能负反馈抑制其合成途径中关键酶的活性,从而使其在诱导后期含量下降。此外,50μmol·L^-1的茉莉酸甲酯对地黄毛状根总环烯醚萜苷积累的诱导作用可能不明显。     

月季种质资源花色多样性及其与花青苷的关系

利用CIE Lab测色体系对227个月季种质资源进行聚类分类,将月季花色均匀地分为7个色系。在a*和b*二维图上,各类花色只有第Ⅲ象限没有分布,即月季中没有蓝色花;根据227个被测品种的彩度值(C*)与亮度值(L*)二维分布图,可将其分为3大类群。大部分种质资源的亮度(L*)与彩度(C*)表现为负相关,分别为以白色和黄色为主的第1类群和以粉色、大部分玫红色、紫红色和橙红色第2类群;但在包括深红色和部分玫红色资源的第3类群中,L*与C*呈正相关关系。HPLC测定结果发现,6种花青苷在101份试验材料中均被检测到,其中含量贡献最大的是矢车菊素–3,5–双葡萄糖苷(Cy3G5G)和天竺葵–3,5–双葡萄糖苷(Pg3G5G);随着花瓣颜色的加深,其花青苷种类和含量也相应地增加,其中第3类群花青苷含量远大于其他两个类群。上述结果表明,月季种质资源存在丰富的花色多样性。进一步的相关性分析发现,6种花青苷总含量(TA)与L*呈负相关关系;与第1、2类群的a*或C*正相关,但在第3类群中呈现负相关。第1类群花青苷与测色参数L*、a*、b*、C*不存在相关性;第2类群中两类Pg花青苷与a*、b*、C*均存在显著正相关,但与L*无显著相关,表明Pg类花青苷只影响花瓣颜色;在第3类群中,只有含量最高的花青苷Cy3G5G与L*、a*、C*存在显著负相关关系,表明Cy3G5G含量的增加既减弱了花瓣亮度也降低了其彩度。     

发根农杆菌K599对菊花活体转化及其高效再生

 发根农杆菌K599侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根,生根频率为88.0%;不定根经过诱导培养形成愈伤组织,并再生完整植株,愈伤组织诱导率和分化率分别为75.0%和63.3%。诱导的不定根和再生植株经过PCR鉴定含有K599 Ri质粒中的rolC基因,qRT-PCR检测显示rolC基因在再生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征,并能正常开花。建立的利用活体材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系,能克服假阳性不定根的出现;同时,利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点,通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养,结合使用头孢霉素杀菌,能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的,在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌,提高了转基因再生效率,为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了良好的试验体系。     

长期培养的黄瓜毛状根中外源基因遗传稳定性分析

 对在固体培养基上培养3 年的黄瓜转gfp 基因毛状根进行gfp 和rol 位点系列基因的PCR 扩增、gfp 的荧光定量PCR、Western blot 杂交以及荧光观察分析。结果显示,由组成型启动子35S 驱动的gfp 在转录水平上能正常表达,而且能够翻译出编码蛋白;此外,培养3 年后的毛状根,能扩增出与毛状根形态构成有关的rol 系列基因。本研究结果表明长期培养的毛状根能保持其遗传稳定性,这为利用毛状根长期工厂化生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分提供了理论依据。     

苹果愈伤组织超表达MdNAC029促进花青苷积累

以‘光辉’海棠(Malus spectabilis‘Guanghui’)与‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)杂交后代中分离出来的红肉苹果果实为试验材料,克隆得到1个NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子基因,命名为MdNAC029。该基因开放阅读框(ORF)为843 bp,编码含有280个氨基酸的蛋白。保守结构域分析显示,MdNAC029蛋白在N端包含1个保守的NAC结构域。基因表达分析显示该基因在红肉苹果果实中表达量较非红肉果实高。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdNAC029,其花青苷积累显著增加,表明MdNAC029在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含1个MdNAC029转录因子的结合位点。同时,烟草瞬时表达试验显示,MdNAC029能够激活MdMYB1基因的表达。由此推测,MdNAC029可能通过直接促进MdMYB1基因的表达,正向调节花青苷的积累。     

苋菜中甜菜红素代谢相关基因AmMYB2的表达与功能分析

为了研究AmMYB2基因在苋菜(Amaranthus tricolor)甜菜红素合成中的作用,对红色苋菜品种‘大红’AmMYB2(登录号为KY814751.1)进行生物信息、基因表达及功能分析。结果表明:AmMYB2的开放阅读框(ORF)全长为678 bp,编码蛋白分子质量为25.96 kD,该蛋白具有R2R3型MYB结构域,属于R2R3型MYB转录因子。核酸序列分析结果显示,AmMYB2与甜菜红素合成相关的甜菜BvMYB1和苋菜AmMYB1的相似度分别达到62.11%和49.93%。亚细胞观察显示,AmMYB2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量(qPCR)分析发现,AmMYB2在红色苋菜品种的表达量高于绿色苋菜品种;在‘大红’苋菜中,不同组织以及叶片不同部位中AmMYB2的表达量与甜菜红素含量成正比。构建AmMYB2过表达载体,将其转入烟草和拟南芥中,发现该基因能够在这两种植物中高水平表达,但不会引起颜色变化,揭示AmMYB2可能是苋菜中甜菜红素合成的正调控因子,可能不参与花青素的合成。     

中国水仙R2R3-MYB基因NtMYB5的克隆和功能研究

为研究中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）中类黄酮代谢途径的调控网络,从其转录组中筛选出1条R2R3-MYB基因并从花瓣cDNA中克隆其编码区全长序列,命名为NtMYB5。NtMYB5开放阅读框为681 bp,编码226个氨基酸。蛋白多重序列比对分析发现NtMYB5含有R2和R3结构域以及1个pdLNLD/ELxiG/S氨基酸基序;系统进化树分析表明,NtMYB5与花青素合成抑制因子亲缘关系最近;通过对NtMYB5在中国水仙中的表达检测发现,其表达量在花器官中较高,且随花开放逐渐上升;在烟草瞬时表达中,NtMYB5显著抑制花青素合成促进因子StMYB的效果;转NtMYB5烟草花瓣颜色变浅,qPCR检测表明NtMYB5抑制类黄酮代谢途径大部分结构基因表达。NtMYB5为中国水仙中花青素合成抑制因子。     

基于颠茄发根的外源基因表达系统的建立

 用携带植物高效表达载体pCAMBIA1304 ⁺ “解除武装”的重组C58C1工程菌转化颠茄无菌苗真叶, 发根诱导率达100%。PCR检测证实发根型质粒pRiA4和表达型质粒pCAMBIA1304 ⁺均能整合到颠茄发根基因组内, 共转化率达30%。建立了基于颠茄发根的高效外源基因表达系统, 为将托品烷类生物碱东莨菪碱的生物合成关键酶基因导入颠茄, 实现其次生代谢工程及开展分子育种奠定了基础。     

苹果SUPERMAN家族基因的组织特异表达及MdSUP3的功能分析

通过半定量RT-PCR分析SUPERMAN家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式,通过MdSUP3自主启动子驱动的GUS基因表达和MdSUP3异位表达分析其功能。结果表明,MdSUP3、MdSUP11和MdSUP9a在所检测的组织器官中均有表达,MdSUP9b主要在营养器官中表达,MdSUP5a、MdSUP1b主要在生殖器官中表达。MdSUP3启动子驱动GUS基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达MdSUP3的转基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常;与对照相比,转基因烟草中ABA合成酶基因NtNCED3-2,花青素合成途径的NtDFR2和NtANS1基因表达显著上升,细胞分裂素氧化酶基因NtCKX和赤霉素氧化酶基因NtGA2ox4表达显著下降。异位过量表达删除C端DLELRL基序的MdSUP3基因不影响转基因烟草的生长发育,证明DLELRL是基因必不可少的功能域。     

外源6-BA对‘美乐’葡萄花色苷合成的影响

【目的】探究6-BA对葡萄花色苷合成的影响。【方法】以酿酒葡萄’美乐’为试材,喷施不同浓度的6-BA,以喷施清水为对照,研究6-BA对花色苷含量、组分及其生物合成途径相关基因表达的影响。【结果】100和200 mg·L^-16-BA处理提高了果实着色百分率和内源激素ABA的含量,其中200 mg·L^-1处理促进了花青素的积累,其含量是对照组的4.82倍,相关性分析表明200 mg·L^-1处理组的蔗糖与花色苷含量呈显著正相关。100和200 mg·L^-16-BA处理组的葡萄果实CHS1、F3’H、F3’5’H和UFGT基因的表达量在花后90 d显著提高,6-BA处理组通过影响F3’H和F3’5’H基因的表达量来影响不同花色苷的含量,从而影响果皮色泽。【结论】在果实着色后期,低质量浓度的6-BA通过提高内源激素ABA、可溶性总糖的含量以及相关基因的表达量,促进了花色苷的积累,其中200 mg·L^-16-BA处理效果更佳。