中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤–2’白藜芦醇含量高,并抗白粉病。以此为材料,利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因VqSTS12和VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化,分别获得7个VqSTS12和5个VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量PCR分析发现,与野生型植株相比,转基因植株中芪合酶基因STS与下游白藜芦醇糖基转移酶基因RSGT表达量升高,与STS有底物竞争关系的查尔酮合酶基因CHS表达量降低。STS的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现,转基因植株对白粉菌的敏感性降低,发病较晚,病情较轻,在转基因植株上部分孢子萌发受抑制,菌丝发育迟缓。转基因植株中VqSTS12和VqSTS25受白粉菌诱导表达:在接菌后1～3 d内表达量显著升高,随后略有下降,在6～7 d表达量再次上升。同时高效液相色谱(HPLC)检测到STS的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄VqSTS12和VqSTS25及其表...     

中国野生华东葡萄芪合成酶基因启动子转化番茄的研究

中国野生华东葡萄"白河-35-1"中的芪合成酶基因启动子被证明具有病原菌和胁迫诱导表达活性。现将芪合成酶基因置于增添不同增强子的该启动子下,构建4个植物表达载体,通过农杆菌介导法进行了转化番茄的研究,并对转基因株系抗番茄灰霉病表现及其白藜芦醇含量变化进行了测定。结果表明:经PCR-Southern鉴定,获得转基因株系4个共54株;不同载体转化的番茄株系对灰霉病抗性均高于野生型,但抗性存在差异;添加增强元件enhancer启动子启动的芪合成酶基因表达的番茄株系,可使白藜芦醇含量提高4.4倍。     

不同酿酒葡萄品种白藜芦醇合酶基因的克隆和序列分析

以红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”和白葡萄品种“雷司令”为试材,采用改良CTAB法提取葡萄叶片组织中的DNA,并扩增得到4个酿酒葡萄品种的白藜芦醇合酶基因部分片段.结果表明:红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”的扩增产物均为1 419 bp,白葡萄品种“雷司令”扩增产物为1 417 bp.通过序列多重比较分析,所得到的4个白藜芦醇基因片段与Genbank中河岸葡萄(AF128861)的该基因序列同源性较高(90％以上),外显子区同源性高于内含子;红色葡萄姊妹品种之间、红色葡萄不同品种之间、红色葡萄与白色葡萄品种之间的序列同源性依次递减.     

中国野生葡萄果皮解剖结构与白粉病抗性的相关性研究

以中国野生葡萄刺葡萄、毛葡萄、华东葡萄和欧洲葡萄的10个株系和品种果实为试材,在田间抗病性鉴定基础上,通过解剖观察不同葡萄果实表皮组织结构特点和差异,探究葡萄果实表皮组织结构与抗白粉病的关系。结果表明,刺葡萄‘塘尾’‘福建–4’,毛葡萄‘丹凤–2’‘泰山–12’‘商–24’为抗病种质,华东葡萄‘白河35-1’‘湖南–1’;欧洲葡萄‘无核白’‘红地球’‘佳丽酿’为敏感品种。刺葡萄、毛葡萄、华东葡萄的表皮角质层比欧洲葡萄‘无核白’厚,刺葡萄和毛葡萄表皮层细胞排列规则且紧密,而欧洲葡萄‘无核白’表皮角质层最薄,表皮层细胞排列不规则且松散。刺葡萄‘塘尾’表皮层和亚表皮层细胞最厚,毛葡萄‘丹凤–2’和华东葡萄‘白河35-1’次之,欧洲葡萄品种‘无核白’的表皮层和亚表皮层最薄。相关性分析表明,葡萄果皮角质层厚度、表皮层厚度与对白粉病的抗性显著正相关,抗病种质的果皮角质层与表皮层厚度普遍厚于感病种质。     

中国野生华东葡萄抗白粉病相关基因(VpUSP)克隆及表达分析

根据从本课题组前期构建的中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下的cDNA文库中获得的1条与抗白粉病相关的EST序列,设计特异引物,结合RACE(Rapid-amplrfication of cDNA ends)技术克隆了中国野生华东葡萄白河-35-1广泛逆境蛋白基因(Univetsal stress pr...     

中国野生葡萄芪合成酶基因STS19及其启动子的克隆与功能分析

以中国野生山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）‘通化3号’和刺葡萄（V. davidii Foex.）‘塘尾’为材料,克隆得到芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19。序列分析发现VaSTS19和VdSTS19的编码区均为1 179 bp,编码392个氨基酸,定位于16号染色体,二者核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.81%和98.21%。亚细胞定位结果显示VaSTS19和VdSTS19均定位于细胞膜、细胞质和细胞核。将35S强启动子连接VaSTS19和VdSTS19转入番茄能显著促进STS19的表达及番茄中白藜芦醇的合成和积累。分别从两种材料中克隆得到VaSTS19和VdSTS19的启动子。顺式作用元件分析表明,二者启动子中均包含多个胁迫应答元件、激素应答元件及光应答元件。序列分析发现二者启动子序列与欧洲葡萄VST2启动子序列同源性为60%。转基因烟草叶片中二者不同长度启动子片段对SA和MeJA诱导响应明显。结果表明STS19的表达模式和白藜芦醇的合成可能与其上游启动子类型和调控有关。     

华东葡萄泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的抗白粉病特性分析

【目的】分析华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’的Ring型泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的转基因植株对葡萄白粉病的抗性,研究这2个基因的抗白粉病特性,为改良欧洲葡萄抗病性提供可用基因。【方法】利用同源克隆的方法获得中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的编码区序列(CDS);通过实时荧光定量PCR方法检测其在白粉菌诱导和水杨酸处理后的葡萄叶片中的表达;使用聚乙二醇(PEG)介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位;通过农杆菌介导法获得转基因‘无核白’和‘红地球’植株;经过苯胺蓝染色,利用血球计数板计数分析白粉菌在转基因植株叶片上的生长情况,鉴定转基因株系的抗病性。【结果】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3响应白粉菌和水杨酸处理,表达模式明显区别于感病对照‘赤霞珠’。中国野生华东葡萄‘白河-35-1’VpUIRP2蛋白定位在细胞质,VpUIRP3蛋白定位无特异性。通过农杆菌介导的遗传转化获得4个VpUIRP2的转基因‘红地球’株系和1个‘无核白’株系,转基因株系对白粉病表现出抗性。【结论】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2能增强葡萄对白粉病的抗性,可以作为抗病基因用于改良欧洲葡萄的抗病性。     

中国野生葡萄种间杂交F_1代抗黑痘病遗传研究

用原产我国野生葡萄5种11个株系和9个欧洲葡萄品种杂交,组合成抗病×抗病和抗病×感病两类,获F_1代杂种1238株,采用田间自然鉴定的方法研究了亲本抗黑痘病及其在F_1代的遗传表现。结果表明,中国葡萄属野生种抗黑痘病在F_1代表现为极强的显性遗传特性。     

中国葡萄属野生种抗白腐病的鉴定研究

本文通过田间自然鉴定和田间接种鉴定的方法,研究了起源我国的葡萄属12个种或变种、46个株系对白腐病的抗性。结果表明:在田间自然条件下,所有野生种的果实不感白腐病;但在接种条件下,不同的种对白腐病的抗性存在着很大的差异,即使在同一种内的不同株系间也存在着显著的、甚至很大的差异。     

中国野生葡萄果实抗白腐病基因的分子标记

 以感病×抗病的葡萄种间杂交组合白玉霓×塘尾的F₁ 代17 个单株及塘尾自交一代16 个单株为试材, 采用BSA 法和RAPD 技术, 通过对155 个随机引物的筛选, 获得了一个与中国野生葡萄抗白腐病基因连锁的RAPD 标记OPP09-760 , 并在中国野生葡萄8 个种的32 个株系及欧洲葡萄16 个品种中得到验证。进一步将该DNA 片段克隆并测序, 根据两端序列, 设计了一对长26 bp 的特异引物分别扩增供试材料, 获得了与该RAPD 标记相同大小的DNA 片段, 成功地将RAPD 标记转化为SCAR 标记, 可以用作抗白腐病基因的分子辅助选择的依据。     

野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIPs的克隆与组织特异性表达研究

从野生毛葡萄组织中克隆了9个质膜水通道蛋白基因（VhPIP）的cDNA全长序列,并研究了其生物信息学特征及组织特异性表达。氨基酸序列分析表明,9个VhPIP分为PIP1和PIP2两类;均含有MIP蛋白家族保守的信号序列SGGHINPAVT和两个NPA（Asn-Pro-Ala）单元,均为稳定性蛋白、疏水性蛋白,且每个VhPIP均含有6个跨膜区。实时荧光定量RT-PCR分析表明,这9个VhPIP在抗旱的毛葡萄‘花溪–9’根、茎、叶中均有表达,其中VhPIP1;1、VhPIP1;2、VhPIP1;4、VhPIP2;1、VhPIP2;2和VhPIP2;4在其根中的表达量最多,可能与根部水分运输的调节密切相关;VhPIP1;5和VhPIP2;3在其叶中的表达量最多,可能主要参与叶片的水分运输,与叶片的蒸腾作用密切相关;VhPIP1;3在根、茎和叶中的表达量无显著性差异;相对于其他基因的表达,VhPIP1;1和VhPIP2;4在根中表达量最高,这两个基因可能在水分运输过程中起较大作用。     

中国野生葡萄病原菌诱导响应VqSAP基因的克隆及表达分析

【目的】为了验证SAP基因在葡萄抗病防御机制中的作用,【方法】在前期通过抑制消减杂交技术(SSH)获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’衰老相关蛋白(SAP)基因EST序列的基础上,采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到SAP基因cDNA序列,并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了SAP基因的表达特异性。【结果】序列分析表明该基因具有完整的的开放阅读框,序列长度为819 bp,编码272个氨基酸残基,相对分子质量为30.56 ku,等电点为8.78,将其命名为VqSAP。多重比较结果显示VqSAP基因与油棕、玉米、萱草、拟南芥、水稻等植物SAP基因的同源性为65%~74%。实时定量结果表明,在白粉菌诱导初期,抗病的毛葡萄株系‘商-24’和感病的华东葡萄株系‘湖南-1’VqSAP基因表达量均升高,这可能是因为它参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程。水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(Eth)处理表明衰老相关蛋白基因表达受激素分子调节,但在抗病和感病株系中基因的表达量有所差异。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqSAP基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqSAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。     

BTH处理对不同生育期甜瓜抗白粉病的诱导效应

以幼苗期、伸蔓期和幼果期的黄河蜜甜瓜为试材,研究了苯并噻二唑(BTH)处理对3个生育期甜瓜植株抗白粉病的诱导效应。结果显示:0.25mmol·mL-1BTH对幼苗期和伸蔓期甜瓜植株的诱导效果显著高于幼果期甜瓜植株,而伸蔓期和幼苗期植株之间病情指数差异不显著;0.25mmol·mL-1BTH处理后,幼苗期甜瓜植株叶片中β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性在接种白粉菌后增幅最大,伸蔓期次之,幼果期最小;无论是诱导+接种的植株,还是只接种的植株,叶片中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性高峰都随着苗龄增大呈现出不断推迟的现象。     

干旱风沙区塑料大棚厚皮甜瓜不同品种抗病性研究

在宁夏干旱风沙区塑料大棚对引进的10种厚皮甜瓜进行抗病性试验,以期筛选出适应宁夏地区种植的抗病品种。结果表明:对白粉病、枯萎病都具有抗病性的品种是银利斯、玉美人,它们表现为高抗,白粉病病情指数是24.4、27.8,枯萎病病情指数是20.0、25.0,具有推广价值,可在宁夏进行大面积试验和示范。     

应用基因芯片检测中国野生葡萄抗白粉病基因表达

 本文研究了利用Affymetrix的欧洲葡萄基因表达芯片检测中国野生葡萄基因表达的可行性,并检测了葡萄白粉菌(Uncinular necator)人工接种诱导后48 h后的基因表达情况。结果表明,该芯片可以在感病材料中检测出表达的基因11 906个,抗病材料中检测到表达的基因11 839个,在二者中同时检出表达的基因11 839个,能够检出的基因数占该芯片基因探针组总数的71.3%,因此用欧洲葡萄基因芯片检测中国野生葡萄中基因表达水平是完全可行的;并利用此芯片检测出在人工接种诱导后,抗病材料中和感病材料相比表达上调的基因共1 920个,占检测出基因总数的16.21%;表达下调的基因数1 760个,占检测出基因总数的14.87%;表达上调和下调的幅度(signal log ratio)都在1~7倍之间。     

华东葡萄广西-2花药胚状体诱导与再生植株的研究

为了提供葡萄转抗病基因功能验证及遗传转化研究的再生技术体系,以中国野生华东葡萄(V.pseudoretic-ulata)感白粉病株系广西-2的花药为试材,进行了体细胞胚诱导与再生体系的建立,并探讨了次生胚的诱导与畸形萌发胚状体正常成苗的方法。结果表明,广西-2花药在B5+6-BA4.0mg·L-1+2,4-D0.7mg·L-1+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖30.0g·L-1培养基上继代3个月,可诱导胚性愈伤组织产生;B5+6-BA4.0mg·L-1+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖15.0g·L-1培养基有利于胚状体形成;胚状体在1/2B5+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖15.0g·L-1的液体培养基比相同成分固体培养基中早萌发14d左右;已萌发胚状体在WPM+IBA0.15mg·L-1+AC0.5g·L-1+蔗糖15.0g·L-1培养基上可以生根成苗;MS+6-BA1.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30.0g·L-1培养基有利于畸形萌发胚状体正常成苗。发育早期胚状体在B5+6-BA1.0mg·L-1+2,4-D0.5mg·L-1+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖30.0g·L-1培养基上可形成次生胚。     

国家科技攻关白菜抗病育种进展

从白菜病理学研究,抗病性鉴定,抗性遗传规律和抗病机理研究,抗病新品种的选育和推广淫,抗病育种技术研究等５个方面了国家科技攻关白菜抗病育种的主要进展,并对白菜抗病育种的发展趋势和前景进行了探讨。