葡萄病毒A实时荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用

根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好线性关系,扩增效率为99.2%,决定系数为0.999,可特异性检测GVA,灵敏度高（达常规RT-PCR的100倍）,重复性好。对不同季节、不同品种以及不同部位葡萄样品（嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须和休眠枝条）中GVA的检出率普遍高于常规RT-PCR。不同季节间比较,对秋、冬季样品检测效果最好,除嫩叶外其余部位检出率均达100%,春夏季检出率为10% ~ 100%。不同部位间比较,老叶柄和休眠枝条检测效果最好,检出率均达100%,其次为老叶（80% ~ 100%）,其余部位样品检出率为10% ~ 100%。在大量田间样品检测中,休眠枝条样品检测结果与常规RT-PCR一致,而秋季老叶柄样品检出率明显高于常规RT-PCR。     

葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus,GFLV）RNA2序列设计4对特异性引物,通过引物筛选、体系优化,建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998,灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%,显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,最高含量是最低含量的81 245.5倍,与ELISA和巢式RT-PCR相比,实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。     

沙地葡萄茎痘伴随病毒双重巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的沙地葡萄茎痘伴随病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV）全基因组序列设计了2组巢式RT-PCR检测引物repF1/R1→repF2/R2和cp F1/R1→cpF2/R2，扩增片段分别为902 bp和438 bp。通过对第1轮PCR扩增中引物组合repF1/R1-cpF1/R1、dNTPs、Taq DNA聚合酶和c DNA用量的优化，以及第2轮PCR扩增中引物组合repF2/R2-cpF2/R2、dNTPs和Taq DNA聚合酶用量的优化，建立了GRSPaV双重巢式RT-PCR检测方法。采用该方法对109份葡萄样品进行检测，结果显示，2对普通PCR引物RSP 52/53和RSP 9F/9R的合计检出率为65.1%,2组单一巢式PCR引物repF1/R1→repF2/R2和cp F1/R1→cpF2/R2的检出率总和为93.6%，而双重巢式PCR引物组合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2的检出率也达到93.6%。该技术在保证检测效率的基础上降低了检测...     

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄病毒病田间自然发病率调查及检测

对宁夏贺兰山东麓8个酿酒葡萄种植地区8个葡萄品种的病毒病田间自然发病情况进行调查,采用RT-PCR方法,检测了40份样品中GLRaV-1~5这5种葡萄卷叶伴随病毒的感染率。结果表明:宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄主要病毒病有葡萄卷叶病、扇叶病和栓皮病,其中葡萄卷叶病尤为严重;不同酿酒葡萄种植区和品种间葡萄卷叶病的感染存在着差异,老葡萄种植区中品种间葡萄卷叶病发病率明显高于新葡萄种植区的品种;"蛇龙珠"和"黑比诺"是感染葡萄卷叶病毒的主要品种,发病率高达85.1%和52.7%;利用5种葡萄卷叶伴随病毒引物进行RT-PCR检测,检出3种病毒类型,且GLRaV-3的检出率最高,为87.5%。     

葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测

2010—2011年我们对河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县(区)以及北京市葡萄卷叶病的发生情况进行了调查,并对采集的葡萄植株样品用RT-PCR方法检测病毒种类。在检测的82个样品中,葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)的检出率为100.0%,葡萄卷叶伴随病毒1号(GLRaV-1)的检出率为17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)的检出率为11.0%;病毒混合侵染的样品占总检测样品数的28.1%,其中葡萄卷叶伴随病毒1号、3号混合侵染样品占总检测样品数的17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号、3号混合侵染的样品占总检测样品数的11.0%,且在这些被病毒混合侵染的样品中,有2个样品被葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号三重侵染。     

葡萄卷叶病毒3 RT-PCR检测技术研究

采用改进的二氧化硅吸附法和2组特异性引物进行葡萄卷叶病毒3(GLR aV-3)RT-PCR检测。结果表明,二氧化硅吸附法提取总RNA纯度好、浓度高、操作简便;随机引物合成cDNA能同时用于多种病毒及不同引物的PCR,可简化检测程序,降低检测费用;LC 1/LC 2引物进行RT-PCR检测,病毒检出率高于PU/PD引物和EL ISA方法。建立了规范、灵敏、稳定、快速、经济的GLR aV-3RT-PCR检测技术体系。     

酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRa V-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRa V、GLRa V和GFKV以及GFLV和GLRa V。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRa V-2以及引物GLRa V-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRa V-1阳性,3份为GLRa V-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRa V-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRa V-2或GLRa V-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。     

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。     

中国葡萄卷叶相关病毒7检测及基因变异分析

葡萄卷叶相关病毒7(grapevine leafroll-associated virus 7,GLRaV-7)是与葡萄卷叶病相关的重要病原物之一.为明确中国GLRaV-7分离物的基因序列变异,采用RT-PCR方法对采自中国15个省(市)、自治区的188份葡萄样品进行检测,检出率为24.5％ (44/188).对来源于...     

马铃薯Y 病毒实时荧光定量RT-PCR 检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank 已登录序列设计引物建立了马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）实时荧光定量RT-PCR 检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，相关系数R² 为0.991 2，可特异性检测PVY，灵 敏度达常规RT-PCR 的1 000 倍，重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5 个地区 马铃薯植株中的PVY 进行检测，检出率较常规RT-PCR 技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00 百分点。因此，建 立的PVY 实时荧光定量RT-PCR 检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株 中PVY 的含量，为马铃薯Y 病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定

为明确北京地区南瓜病毒病种类及其主要侵染病原,2016~2017年在北京周边采集疑似感染病毒的南瓜病样84份,并根据南瓜上的6种病毒特异性引物对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明:共有79份南瓜病样检测显示阳性,其中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的检出率最高,为52.38%;其次是小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV),检出率分别为44.01%、14.29%,其他病毒暂未检出。此外,16.67%的样品受2种病毒复合侵染,CMV和ZYMV复合侵染占7.14%,ZYMV和WMV复合侵染占9.52%。北京地区南瓜上优势病毒种类为CMV,且存在病毒复合侵染现象。     

苹果两种树形叶片对光强和CO2浓度互作的光合响应及光抑制特性

以山西省临猗县32年生的‘长富2号’苹果树为试材，以传统郁闭的圆头大冠形为对照，改造后的开心形为处理，测定叶片光合作用在不同叶片表面CO2浓度（Cs）下的光响应和在不同光合有效辐射（PAR）下的CO2响应以及光抑制前后的净光合速率Pn、光呼吸速率Pr和热耗散NPQ变化。结果表明：与自然大气状态下Cs相比，Cs升高到2 000 μmol • mol-1时，开心形和圆头大冠形的叶片最大净光合速率Pnmax分别提高151%和83.5%，光能利用范围分别提高45.8%和87.5%；Rubisco限制的最大羧化速率、最大电子传递速率和磷酸丙糖利用速率均随PAR增加而增大，且在1 500 μmol • m-2 • s-1的PAR下达到最大值。光抑制发生前（8：00—10：00）开心形的叶片Pn和Pr显著高于圆头大冠形，但NPQ无显著差异；光抑制期间（12：00—14：00）两种树形的叶片Pn均显著降低，Pr和NPQ中可恢复组分r(qE)均显著增强且开心形显著高于圆头大冠形；光抑制解除后（16：00—18：00）开心形叶片Pnmax上升42.6%而圆头大冠形无显著变化。综上，CO2浓度升高和PAR增加（饱和光强以下）对叶片光合有正互作效应；开心形树形叶片光合能力显著提高，光抑制时可通过更高效的光呼吸和热耗散自我保护，光抑制过后Pn明显恢复。     

广西辣椒病毒病调查及病原种类初步鉴定

对广西9个市县辣椒病毒病的发生情况进行初步调查,并采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)鉴定75份辣椒疑似病毒病样本的8种常见蔬菜病毒。结果表明,桂南、桂中地区辣椒病毒病发生普遍较桂西、桂北地区的严重。共有71份辣椒样本检测呈阳性,其中辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,Chi VMV)的侵染最普遍,总检出率最高,达63.38%,为广西辣椒的优势病原种类;甜椒叶脉斑驳病毒(Pepper vein mottle virus,PVMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMo V)、辣椒环斑病毒(Chilli ring spot virus,Chi RSV)的侵染也很普遍,总检出率分别为56.34%、43.66%、35.21%和33.80%。在71份阳性样本中,有87.32%的样本受2种及2种以上病毒的复合侵染,受2种或3种病毒复合侵染的分别占32.39%和29.58%;2种病毒复合侵染类型中,以ChiVMV+CMV、PVMV+PMMo V复合侵染最普遍,均占21.74%;3种病毒复合侵染类型中,以Chi VMV+CMV+PVMV复合侵染最普遍,占23.81%。     

我国辣椒病毒病发生情况及发展趋势——基于2018年和2019年辣椒主产区的调查

为明确我国辣椒病毒病的种类和发展趋势，2018 年和2019 年在我国16 个省（市、自治区）辣椒主产区采集具有病毒病疑似症状的样品105 份，利用双抗体夹心酶联免疫吸附反应（DAS-ELISA）对12 种辣椒主要病毒进行检测。结果表明，有70 份样品为病毒病感染样品，病毒检出率为66.67%。检出病毒种类共10 种，其中辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）检出率最高，为24.76%，其次为黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、蚕豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus，BBWV）、烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV），检出率分别为19.05%、12.38%、12.38% 和10.48%。我国辣椒主产区多种病毒复合侵染发生较为普遍，病毒复合侵染率为40%，其中以2 种病毒复合侵染比例最高，为28.57%。通过对两年辣椒病毒病检测结果进行比较，12 种病毒中有7 种检出率有上升趋势。总体而言，PMMoV 和CMV 为近两年危害我国辣椒生产较为严重的病毒病；此外，PMMoV、BBWV_-1，2、TEV、TSWV 具有流行风险，需要严加防范。     

红芽芋脱毒试管芋诱导及植株再生

为解决红芽芋脱毒苗移栽成活率低、种苗易分化等问题，以江西地方名优芋品种‘铅山红芽芋’为材料，开展茎尖脱毒、试管芋诱导及植株再生的研究。结果表明，芋芽剥取0.2 ~ 1.0 mm茎尖接种于MS + 2.0 mg • L-1 6-BA + 0.5 mg • L-1 NAA + 3%蔗糖培养基中可诱导成苗；通过RT-PCR分子检测，0.3 mm以下茎尖培养的试管苗中未发现芋花叶病毒（DsMV）；脱毒苗继代增殖最佳诱导培养基为MS + 3.0 mg • L-1 6-BA + 0.5 mg • L-1 NAA + 3%蔗糖，脱毒苗试管芋诱导的最佳培养基为MS + 1.0 mg • L-1 6-BA + 0.5 mg • L-1 NAA + 8%蔗糖，最佳培养条件为温度25 ℃，光照54 μmol • m-2 • s-1，光周期14 h • d-1；脱毒试管芋的最佳移栽驯化基质为草炭︰蛭石 = 2︰1；脱毒试管芋移栽后，成活率达97.71%，生长中未出现分化现象。脱毒芋相比未脱毒芋增产43.14%，营养品质指标存在显著差异。脱毒试管芋的诱导形成及植株再生体系的建立为红芽芋健康种苗的快速繁殖提供了一条新途径。