柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

百子莲脱水素基因ApSK_3对逆境与激素信号的应答模式与调控机制

克隆了百子莲(Agapanthus praecox)脱水素基因ApSK_3上游2 195 bp的启动子序列,对百子莲不同组织和多种非生物胁迫与ABA处理的样品进行基因定量分析,构建多个ApSK_3不同长度缺失的启动子片段与GUS基因融合的表达载体并转化拟南芥,以揭示ApSK_3基因对不同逆境与激素信号的应答模式及顺式作用元件的调控功能。结果表明:ApSK_3启动子序列包含多个与植物逆境、激素应答及生长发育相关的顺式作用元件,且ApSK_3的表达具有组织特异性,果实中表达量最高,叶、根次之,花中最低;ApSK_3对ABA信号与盐胁迫最敏感,其次为干旱、高渗和低温胁迫,对高温胁迫响应不明显。ApSK_3-P::GUS融合表达载体转化拟南芥,ApSK_3启动子在拟南芥的整个生长发育过程中均具有较强的表达活性,幼苗根部的表达活性强于叶片,且随着果实的发育成熟启动子的活性明显增强。ApSK_3不同长度缺失的启动子片段分析结果表明–2 175～–950 bp片段对启动子的活性起到重要的调控作用;多个顺式作用元件响应干旱胁迫;ApSK_3-P通过两个ABRE元件共同响应ABA信号;–526～–533 bp的ERE元件参与响应乙烯信号;–561～–567 bp的P-box元件响应了赤霉素信号,–2 175～–1 167 bp区域可以增强对GA的响应。研究结果证明ApSK_3启动子可积极响应干旱、渗透、盐、低温、ABA、GA和乙烯信号;启动子上存在多个顺式作用元件响应干旱胁迫,ApSK_3-P通过两个ABRE、ERE与P-box元件分别响应ABA、乙烯与赤霉素信号。     

菜薹BcAMT1;4启动子的克隆及活性分析

以菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）为材料,利用染色体步移法获得了铵转运蛋白基因BcAMT1;4的ATG上游长度为2 086 bp的启动子序列。生物信息分析表明,该启动子中包含多个光信号、激素信号、逆境应答、组织特异表达等顺式作用元件。构建该启动子与GUS基因的融合表达载体,并用农杆菌介导法转化拟南芥。通过对T3代转基因拟南芥植株GUS活性分析发现,GUS染色主要集中于叶片,而在根、茎、花中染色较浅。此外,不同氮源也影响BcAMT1;4启动子的活性,缺氮处理提高了转基因拟南芥GUS表达活性,而分别供0.25 mmol ? L-1 NO3-、NH4+和NH4NO3的处理在一定程度上抑制其表达活性。研究结果表明,BcAMT1;4可能对菜薹叶片铵态氮营养具有重要调控作用。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

山梨B-box基因PuBBX24表达特性及其在童期调控中的功能分析

为了解PuBBX24基因在梨生长发育过程中的功能,以山梨(Pyrus ussuriensis Maxim.)实生苗为试材,分离PuBBX24及其启动子序列,qRT-PCR分析PuBBX24在山梨根、茎、花、叶片以及果实中的表达特性,对启动子顺式作用元件进行预测,获得PuBBX24启动子驱动GUS基因表达的转基因拟南芥并进行不同组织、不同生长发育阶段,以及ABA、非生物胁迫和不同光处理下PuBBX24基因启动子活性分析,同时在拟南芥中异源表达PuBBX24并验证其功能。结果表明,PuBBX24在山梨根、茎、叶、花以及果实中均有表达,但在茎中表达量最高,叶片表达量最低,且在由童期向成年期发育的叶片中表达水平逐渐降低。PuBBX24上游启动子序列中包含一系列响应激素、光、胁迫等顺式作用元件。而PuBBX24启动子驱动的GUS基因主要在转基因拟南芥叶片、下胚轴以及萼片中表达,且在叶片中的表达水平随童期向成年期的发育而逐渐降低,在根中表达不均匀,在柱头和花柄中表达水平较低,在角果中未检测到GUS活性。PuBBX24启动子显著响应ABA、光、低温、渗透以及盐胁迫处理,且PuBBX24的过量表达影响了转基因拟南芥植株童期—成年期阶段转变进程。这些结果表明,山梨PuBBX24可能参与ABA、光以及胁迫响应,同时在童期—成年期阶段转变过程中起负调控作用。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1 启动子活性的调节作用

 通过反向PCR 方法克隆得到月季（Rosa hybrida L.）‘萨蔓莎’质膜型水孔蛋白基因RhPIP1;1 上游2 126 bp 的启动子序列。PLACE 分析发现，RhPIP1;1 启动子序列中含有GA、ABA 和乙烯等激素诱 导相关顺式作用元件及干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫相关顺式作用元件。在RhPIP1;1promoter：：GUS 转基因拟南芥中发现，RhPIP1;1 启动子活性与植株发育进程相关；几乎所有器官均可检测到GUS 表达， 而且在迅速扩展的器官以及叶片和花的维管组织中尤为强烈。同时在6 d 和9 d 苗龄的转基因植株中，GA 处理上调了莲座叶中RhPIP1;1 启动子的活性，而ABA、甘露醇、NaCl 和冷处理分别下调了莲座叶和根 中RhPIP1;1 启动子的活性。将RhPIP1;1 启动子不同长度的5′端缺失片段融合GUS 基因，并在烟草叶片 中瞬时表达，缺失–580 ~–256 之间的324 bp 片段后，启动子活性显著降低。研究结果表明RhPIP1;1 启 动子对多种激素和非生物胁迫存在响应，并且这种响应具有发育和器官特异性；RhPIP1;1 启动子中–580 ~ –256 区段对于启动子活性具有重要的作用。     

AtGDPD-Like 6和AtGDPD-Like 7基因启动子表达特性及AtGDPD-Like 6蛋白定位

以野生型(Col-0)拟南芥为试材,采用RT-PCR法,研究AtGDPDL6和AtGDPDL7基因组织表达特性。以ProAtGDPDL6::GUS和ProAtGDPDL7::GUS转基因拟南芥为试材,采用GUS组织化学染色法,研究AtGDPDL6和AtGDPDL7基因启动子表达模式,并以Pro35S::AtGDPDL6-GFP转基因拟南芥为试材,采用激光共聚焦显微镜进行荧光观察,研究AtGDPDL6蛋白的细胞内定位。结果表明:AtGDPDL6基因在拟南芥花组织中特异表达;AtGDPDL7基因在花和角果中特异表达。AtGDPDL6和AtGDPDL7基因特异表达在拟南芥成熟的花粉囊和柱头中。AtGDPDL6蛋白定位于细胞膜和细胞壁区域。     

番茄SlIAA14基因启动子克隆及分析

为了深入研究SlIAA14基因的表达模式及其调控番茄根系发育的分子机理,利用染色体步移技术从番茄品种‘Ailsa Craig’中克隆到该基因上游2 197 bp的启动子片段。生物信息学分析表明,该启动子片段中含有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素响应的顺式作用元件,以及对干旱和伤害等逆境胁迫响应的顺式作用元件。利用农杆菌介导的遗传转化方法获得SlIAA14：：GUS + YFP融合基因的转基因番茄植株,转基因植株根系YFP和GUS检测结果显示,该启动子片段在番茄根尖和侧根原基有较高的表达活性,表明SlIAA14基因可能调控番茄根系的伸长和侧根发育的起始。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

海南杜鹃热诱导基因RhRCA1启动子的克隆与功能分析

为了阐述RhRCA1基因的调控机制,以海南杜鹃(Rhododendron hainanense)3年生扦插苗为材料,分析Rh CA1高温响应和组织表达特性;并克隆获得RhR CA1的启动子序列,将该启动子分别驱动荧光素酶报告基因在烟草中瞬时表达、GUS报告基因在拟南芥中稳定表达,分析该启动子活性、组织特异性和热诱导性....     

杏CCD1和CCD4启动子克隆及顺式作用元件分析

以‘轮台小白杏’杏果实为材料，根据转录组数据库中的CCD1和CCD4基因片段，通过基因组步移法克隆了两个启动子pPaCCD1和pPaCCD4，获得了长度分别为2 233和1 838 bp的启动子序列。利用PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析，结果表明两个启动子均含有多个光响应、脱落酸和茉莉酸甲酯等共有顺式作用元件，此外，PaCCD1启动子中含有刺激诱导和种子特异性调控等响应元件，PaCCD4启动子中含有赤霉素、低温和增强转录水平等响应元件，这暗示PaCCD1和PaCCD4的表达可能受光信号、激素和胁迫等多种信号的共同调节。为进一步确定其启动子核心区，基于基因结构特征与顺式作用元件的分布情况，分别构建两个不同长度缺失启动子与GUS基因融合的表达载体并瞬时转化烟草叶片。GUS活性检测发现，在PaCCD1的启动子上游–2 174 ~–1 700 bp、–1 700 ~–1 200 bp、–1 200 ~–600 bp区间内均包含影响启动子活性的顺式作用元件；PaCCD4启动子在上游–1 740 ~–1 200 bp和–1 200 ~–600 bp这两个区间内含有顺式作用元件，随着启动子片段的缺失，PaCCD1和PaCCD4的GUS活性逐渐减弱。PaCCD1的启动子核心区域在–1 200 ~ 2 174 bp区段内，PaCCD4的启动子核心区域在–1 200 ~ 1 740 bp区段内。     

茄子U6启动子克隆及CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系建立

利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)U6RNA保守序列从茄子(Solanum melongena L.)基因组中鉴定到7个U6 RNA,并采用PCR技术成功克隆其启动子序列.GUS染色结果表明4个茄子U6启动子(SmU6-1P、SmU6-2P、SmU6-4P 和 SmU6-7P)具有转录活性.构建以 ...     

蓝猪耳启动子捕获系统的建立

为了分离基因启动子,构建了陷阱植物表达载体pHAHCA,用农杆菌介导的无启动子GUS方法转化蓝猪耳,经抗性筛选和PCR检测,获得82株转基因植株,转化率达12.5%.12株GUS染色呈阳性,其中10株GUS在叶脉表达,2株在茎和叶脉表达.对转基因植株进行盐胁迫处理,有1株根部出现GUS染色蓝色斑点.通过TAIL-PCR扩增和测序,获得5个T-DNA侧翼序列.     

葡萄类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因VvCBL4的克隆与表达分析

【目的】在京秀(Vitis vinifera‘Jingxiu’)葡萄中克隆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因Vv CBL4及其启动子,分析Vv CBL4的表达特性与逆境胁迫的关系。【方法】用RACE技术克隆Vv CBL4的全长,实时荧光定量PCR检测Vv CBL4在不同逆境下的表达;用同源克隆技术获得Vv CBL4的启动子,在烟草叶片中瞬时表达分析Vv CBL4启动子的活性。【结果】Vv CBL4全长为959 bp,ORF为642 bp,编码213个氨基酸,具有3个EF手钙结合结构域。Vv CBL4在根部表达量最高,其次是果实。Vv CBL4的转录本能对干旱、低温和盐胁迫处理快速做出响应。Vv CBL4启动子富含与逆境响应相关的顺式作用元件。干旱、低温和盐胁迫处理能够增强启动子活性。【结论】获得Vv CBL4及其启动子序列,Vv CBL4的表达能对逆境胁迫做出响应,Vv CBL4启动子的活性受逆境胁迫诱导,说明Vv CBL4在葡萄逆境胁迫反应中具有重要的作用。     

菠萝AcSERK15’上游区(-499/+258bp)转录活性的研究

【目的】探究Ac SERK1启动子的功能,有助于了解Ac SERK1的表达调控模式。【方法】以‘神湾’菠萝(Ananas comosus L.‘Shenwan’)为材料,将Ac SERK1启动子缺失序列与GUS融合,构建植物表达载体,并导入根瘤农杆菌GV3101中。利用农杆菌真空渗透法侵染烟草叶片,并检测GUS活性;利用浸染法转化菠萝胚性愈伤组织获得转基因植株,分析光照、2,4-D和4℃等处理后的GUS表达量。【结果】构建2个Ac SERK1启动子植物缺失表达载体,分别命名为p(-30/+258 bp)和p(-499/+258 bp)。烟草瞬时表达结果显示p(-499/+258 bp)表现出强的GUS活性,p(-30/+258 bp)表现出微弱的GUS活性。q RT-PCR结果表明,光照处理后,GUS表达量降低。相反的,2,4-D和4℃处理转基因菠萝植株后GUS表达量均显著增加。【结论】Ac SERK1启动子-499/-30 bp区段内含有光、生长素和低温响应元件。     

甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究

 为进一步明确甜瓜果实软化的分子机理,构建了ACC氧化酶Ⅰ基因（CmACOⅠ）启动子与GUS基因融合的植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化甜瓜‘甘甜一号’。通过卡那霉素抗性和 PCR检测筛选呈阳性的转化植株,取不同组织进行X-Gluc染色。结果表明,转化植株的根、茎、叶、花、果实等器官组织经X-Gluc染色后,只在花药组织和成熟果果皮中出现蓝色斑点,其余组织均未检出,表明甜瓜CmACOⅠ启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药和成熟果果皮中特异表达。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。