牛病毒性腹泻病毒一步RT-LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,为诊断与监测BVDV提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测BVDV的RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100copies/μl的病毒RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

卷首语

<正>《Agicultural Science&Technlogy》第10期如期刊出,本期以下4篇文章值得关注。河北农业大学动物医学院袁万哲副教授根据GenBank公布的BVBD序列,在其保守序列区域设计了一套LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测BVDV的RT-LAMP方法。该方法能在56℃等温条件下40 min完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。最低能检测到3.74×10~0 copies/μl的病毒RNA,而且与其他病毒无交叉反应。该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

卷首语

<正>《Agicultural ScienceTechnlogy》第10期如期刊出,本期以下4篇文章值得关注。河北农业大学动物医学院袁万哲副教授根据GenBank公布的BVBD序列,在其保守序列区域设计了一套LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测BVDV的RT-LAMP方法。该方法能在56℃等温条件下40 min完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。最低能检测到3.74×10~0 copies/μl的病毒RNA,而且与其他病毒无交叉反应。该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

BVDV与BRV二温式多重PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛轮状病毒(BRV)的保守基因设计了两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立了用于同时检测BVDV和BRV的二温武多重PCR方法,扩增长度分别为244和385 bp.特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV和BRV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;检测灵敏度高,最低能检测到BVDV和RBV各1 pg病毒RNA.建立的BVDV和BRV二温武多重PCR方法,是一种快速、特异、敏感的检测方法.     

猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法的建立与初步应用

[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。     

4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛轮状病毒（BRV）、牛恶性卡他热病毒（MCFV）4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法,为BVDV、BCoV、BRV和MCFV的鉴别诊断提供技术支持。【方法】根据BVDV的5′UTR基因、BCoV的N基因、BRV的VP6基因和MCFV的ORF9基因的保守区域设计引物,克隆目的基因构建标准阳性重组质粒,建立可同时检测4种致牛腹泻病毒的多重荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。用建立的多重荧光定量PCR检测方法对76份临床样品进行检测,并与常规PCR检测方法的结果进行比较。【结果】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法建立的标准曲线线性关系良好,仅可特异性扩增出4种目标基因片段;对BVDV、MCFV、BRV和BCoV的最低检出限分别为9.4×10¹,1.4×10³,9.1×10¹和1.2×10²拷贝/μL,与普通PCR相比,灵敏性高出10～1 000倍;批内、批间差异均小于5%。76份临床样品检测结果显示,多重荧光定量PCR检测结果与普通PCR检测结果的符合率分别为98.7%（BCoV）、97.4%（BRV）、100.0%（BVDV）和100.0%（MCFV）。【结论】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牛腹泻病毒病原的实验室检测。     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒双重RT-PCR方法的建立

参照GenBank上已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪瘟病毒(CSFV)的全基因序列,针对瘟病毒高度保守的5'-UTR设计3条引物,特异性扩增BVDV、CSFV.经过条件优化后,建立了快速鉴别BVDV和CSFV的双重RT-PCR诊断方法,扩增两种病毒的片段,大小分别为260、200 bp.试验证明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,利用双重RT-PCR对临床上60份疑似病料进行检测,双重PCR检测的结果与单重PCR检测结果总体符合率为100％,可用于临床病料检测,为防止猪瘟细胞苗的污染及进行CSFV和BVDV的鉴别诊断提供了有效方法.     

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种灵敏度高、特异性强、重复性好,能快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。根据BVDV的E2基因保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了检测BVDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将标准阳性样品10倍梯度稀释检测灵敏度,用能感染奶牛的其它病毒做对照检测特异性,用临床样本检测重复性。结果表明,该方法与能感染奶牛的其它几种病毒均无交叉反应,检出敏感度达4.87×10~1 copies/μL,比常规PCR检测方法高10倍。同时检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样本,其BVDV检出率为46.27%(31/67)。本研究成功建立了BVDV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为BVDV的快速诊断和定量分析提供了技术支撑,具有很好的应用前景。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein／MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIVRT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。     

猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein/MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50 min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIV RT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。     

水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法（RT-LAMP）检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-PCR灵敏性基本一致。检测结果易于判定。【结论】RT-LAMP检测方法适合寄主植物和介体体内RBSDV的快速检测。