猪卵母细胞激活方法的研究

【目的】探讨猪卵母细胞体外胚胎生产的最佳激活条件。【方法】以不同电场强度(100,150,200,250V/mm)、脉冲时间(2,30,40,60,80μs)、电脉冲次数(1,2,3次)的电激活方法及电激活(电场强度为200 V/mm,脉冲时间为60μs,激活次数为1次)联合化学处理(NCSU-23+CHX、NCSU-23+6-DMAP和NCSU-23+CHX+6-DMAP)方法对猪卵母细胞进行激活,研究不同激活方法对猪卵母细胞孤雌活化的影响。【结果】电激活猪卵母细胞时,在200 V/mm、60μs、1次激活的条件下其卵裂率和囊胚率均最高。电激活联合NCSU-23+CHX、NCSU-23+6-DMAP、NCSU-23+CHX+6-DMAP化学处理时,在孤雌激活后期的卵裂率分别为69.17%,82.31%和79.67%,囊胚率分别为24.17%,39.46%和39.84%,在统计学上各处理间无显著差异。【结论】猪卵母细胞孤雌激活的最佳条件,是在电场强度为200 V/mm,脉冲时间为60μs,激活次数为1次的电激活后,联合NCSU-23+6-DMAP处理4 h,再移入胚胎培养液NCSU-23+4 g/L BSA中继续孵育(40±4)h。     

用乙醇激活与电激活研究猪卵母细胞孤雌激活

以猪的体外成熟卵母细胞为实验材料,研究了乙醇激活、电激活对猪成熟卵母细胞体外孤雌发育的影响.结果表明,2个1.6 kV/cm的60 μs的电激活法卵裂率高(88.68％,94/106);使用8％乙醇处理10 min的卵裂率为84.21％(64/76).2个1.6 kV/cm的60μs的电激活法可以获得更高的卵裂率,为下一步研究奠定基础.     

獭兔体外成熟卵母细胞孤雌激活及体细胞核移植

[目的]建立利用獭兔体外成熟卵母细胞进行孤雌激活及体细胞核移植的技术体系,促进獭兔现代育种技术的发展。[方法]以獭兔屠宰场废弃卵巢为试验材料,利用体外成熟、孤雌激活、体细胞核移植等方法,研究了獭兔体外成熟卵母细胞支持胚胎发育的能力。[结果]1)直径大于1 mm卵泡内的卵母细胞孤雌激活后的发育能力显著强于0.7~1.0 mm卵泡内的卵母细胞。2)卵母细胞体外培养(IVC)15~21 h后孤雌激活,卵裂率显著高于IVC 12 h组。3)2.5μmol·L-1Ionomycin处理5 min,再用2 mmol·L-16-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)与5μg·m L-1亚胺环己酮(CHX)联合处理1 h,孤雌激活效果最好。4)IVC 14 h后,78%的卵母细胞极体与核偏移角度小于10°;IVC 18 h后,34.6%的极体偏离核的角度大于45°。5)体外成熟的獭兔卵母细胞可以较好支持体细胞核移植的重构胚,核质作用期间采用MG132处理,降低了重构胚的囊胚率。[结论]从大于1 mm卵泡内回收卵母细胞并IVC 18 h后,采用2.5μmol·L-1Ionomycin处理5 min,再用2 mmol·L-16-DMAP与5μg·m L-1CHX联合处理1 h,是獭兔孤雌激活和体细胞核移植的最佳方案。     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究

探讨了不同基础培养液(mTCM-199、NCSU23)和PMSG、HCG浓度、作用时间对猪卵母细胞体外成熟的影响和乙醇及乙醇与各种化学试剂联合处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活、孤雌生殖胚胎发育的影响,最终找到了优异的猪卵母细胞体外成熟培养体系,并确定了乙醇孤雌激活的适宜浓度、作用时间和与不同化学试剂联合处理的适宜组合。结果表明:优化的猪卵母细胞体外成熟培养体系为NCSU23 20 IU/mLPMSG 20IU/mL HCG 10%PFF,激素作用时间为45 h,成熟率可达70.3%±3.9%;乙醇的适宜激活浓度为8%,激活率为29.6% 2.5%;乙醇激活的适宜处理时间为10 min,激活率为32.6%±4.1%;乙醇与CB CHX联合处理的激活率最高,激活率为60.8%±3.2%,卵裂率、3-4细胞率、6-8细胞率分别为45.1%±3.0%、28.6%±3.7%、8.7%±1.2%;乙醇与CB 6-DAMP联合处理的激活率为51.7%±1.9%,卵裂率、3-4细胞率、6-8细胞率分别为41.7%±3.6%、30.3%±4.3%、9.9%±1.8%,虽然激活率、卵裂率低于乙醇与CB CHX处理组,但3-4细胞率、6-8细胞率均高于乙醇与CB CHX处理组(30.3%±4.3%对28.6%±3.7%,9.9%±1.8%对8.7%±1.2%)。因此,乙醇激活的适宜方法为:8%乙醇处理10 min,CB 6-DAMP处理7 h。     

水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法的优化

[目的]了解玻璃化冷冻一解冻及不同孤雌激活条件对水牛卵母细胞发育潜能的影响,为构建完善的水牛卵母细胞孤雌激活培养体系奠定基础.[方法]利用玻璃化冷冻法对水牛体外成熟卵母细胞进行冷冻保存1～2d,解冻复苏后进行孤雌激活,以新鲜的体外成熟卵母细胞为对照,探讨离子霉素浓度、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)浓度和处理时间对玻璃化冷冻复苏后水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响.[结果]与新鲜的体外成熟卵母细胞相比,玻璃化冷冻—解冻复苏后水牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率均极显著降低(P＜0.01).水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,以3.5 μmol/L离子霉素激活5 min联合2mmol/L 6-DMAP培养2h的孤雌激活效果最佳,其卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率分别为60.6％、45.1％、33.7％和14.8％.[结论]水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,其激活阈值发生改变,因此不宜采用与新鲜体外成熟卵母细胞一致的激活程序进行孤雌激活.     

不同激活方法对绵羊体外成熟卵母细胞孤雌生殖的影响

为确定绵羊体细胞核移植胚胎的激活条件,本实验探讨了不同激活方法对绵羊体外成熟卵母细胞的孤雌激活及其后的发育影响.选择体外成熟绵羊卵母细胞,随机分为3组:①电激活 6-DMAP 4h;②I(5μm)5min 6-DMAP 4h;③7%乙醇7min 6-DMAP 4h,培养48h后,各组卵母细胞的卵裂率分别为60.93%,79.96%,78.28%;培养到7d时,各组的桑椹/囊胚发育率分别为17.03%,42.84%,39.39%.化学激活的卵裂率、桑椹/囊胚率显著高于电激活(P<0.05);乙醇与Ionomycin相比,其卵裂率、桑椹/囊胚率差异不显著,但Ionomycin处理组效果稍好于乙醇组.结果表明,电激活、Ionomycin、7%乙醇都可以有效激活绵羊卵母细胞,并孤雌发育到囊胚,Ionomycin的激活效果最佳;同时也比较了不同电压对绵羊体外成熟卵母细胞激活的影响,以1.300kV/cm-1.350kV/cm,脉冲时间10us,脉冲次数为2次,间隔0.5s效果较好.     

TSA对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

为探讨Trichostatin A(TSA)对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响。以卵母细胞孤雌激活为模型,比较TSA浓度、作用时间对孤雌胚胎发育能力的影响。结果表明:(1)与添加0、50、100、200、500nmol/LTSA相比,300nmol/LTSA能显著提高绵羊孤雌胚胎的囊胚率及囊胚细胞数(P0.05);(2)与处理0、5和15h相比,300nmol/LTSA处理10h对孤雌激活的卵裂率没有影响,却能显著提高囊胚率(P0.05);(3)与体外培养阶段添加TSA相比,在体外成熟液阶段添加TSA可降低卵母细胞体外成熟率及胚胎发育能力。因此,在体外培养液中添加300nmol/LTSA,作用10h,能提高绵羊卵母细胞孤雌胚胎发育能力。     

不同因素对小鼠卵母细胞电激活及孤雌发育的影响

研究了卵龄、电脉冲参数、氯化锶、亚胺环己酮(CHX)对小鼠卵母细胞电激活及孤雌发育效果的影响。结果表明,卵龄为17h的小鼠卵母细胞在场强1.0kV/cm,脉冲宽度30μs,2次电脉冲,激活液中含Ca2+、Mg2+和Sr2+的条件下激活后,再于含CHX的培养液中培养,可较好地激活卵母细胞,提高体外孤雌胚的发育率,激活率及桑囊胚率分别可达83.3%和57.5%。     

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

探讨乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响.利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在不添加或添加不同浓度EDTA-Na的成熟培养液中体外成熟44～48 h,挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活,然后移到不添加或添加不同浓度EDTA-Na的胚胎培养液中进行体外培养168 h.结果表明:(1)胚胎培养液中添加适当浓度(25～100 μmol·L-1)EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-Na浓度为100 μmol·L-1时,效果最佳;(2)成熟液和胚胎培养液中同时添加100 μmol·L-1EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用;(3)成熟液或/和胚胎培养液中添加不同浓度EDTANa对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4-细胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响.     

几种不同化学激活方法对牛卵母细胞孤雌激活的影响

为确定牛体细胞核移植胚胎的激活条件 ,比较了几种不同化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞 ,随机分为 9组 :1Ionomycin(I) +6 -甲氨基嘌呤 (D) (ID) ;2 I+D+细胞松弛素 B(CCB) (IDC) ;3I+放线菌酮 (X) (IX) ;4 I+X+CCB(IXC) ;5体积分数 7%乙醇 (E) +D(ED) ;6E+D+CCB(EDC) ;7E+X(EX) ;8E+X+CCB(EXC) ;9Sr2 + +CCB(SC)。Ionom ycin和乙醇的处理时间为 5min,6 - DMAP± CCB的处理时间为 4 h,放线菌酮± CCB的处理时间为 5 h,Sr2 + +CCB的处理时间为 10 h。培养36 h后 ,各组卵母细胞的卵裂率分别为 72 .0 % ,75 .5 % ,81.3% ,85 .1% ,81.7% ,82 .4 % ,74 .4 % ,78.1%和 5 1.0 % ;培养到 196 h时 ,各组的囊胚发育率分别为 18.2 % ,2 4 .5 % ,7.2 % ,11.9% ,11.1% ,19.4 % ,6 .7% ,12 .2 %和 2 .0 %。结果表明 ,在 10 mm ol/ L Sr2 +内培养 10 h不能有效地激活牛卵母细胞 ,Ionom ycin+6 - DMAP± CCB以及乙醇 +6 -DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionom ycin比乙醇对牛卵母细胞的激活作用强 ;6 - DMAP比CHX的激活效果好 ,激活液中 CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利     

蓖麻毒素B链(RTB)酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

采用PCR技术扩增蓖麻毒素B链基因,并克隆入诱饵载体pSos中,成功地构建了酵母双杂交诱饵载体pSos-RTB。将重组质粒与对照质粒共转化入酵母菌cdc25H。结果表明:该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25H无毒性和无自激活作用,且在酵母细胞中定位正确。     

乙醇和电场激活小鼠早期卵母细胞的研究

分别用７０ｍＬ·Ｌ－１乙醇２ｍｉｎ和５５Ｖ·ｍｍ－１电场６４０μｓ一次脉冲,对注射ｈＣＧ１５ｈ的小鼠卵母细胞作激活处理。结果表明：虽然乙醇处理的活化率（５５．４０％）略高于电刺激（４６．９０％）,但二者没有显著差异;与乙醇比较,电激活的卵母细胞能保持良好的发育能力,二者的桑椹胚发育率分别为３１．５１％和９１．３７％,差异极显著（Ｐ＜０．０１）．说明电场作用后卵母细胞的活动更符合其正常的活化规律。     

不同化学激活方法对山羊卵母细胞激活效果的研究

激活是体细胞核移植技术的关键步骤。本研究对常用化学激活剂乙醇、钙离子载体A2 3187和离子霉素以及添加 6 二甲基氨基嘌呤 (6 Dimethylaminopurine ,6 DMAP)和放线菌酮 (cycloheximide ,CHX)对山羊卵母细胞的激活效果以及不同卵龄的卵母细胞激活后体外发育效果进行了比较。结果表明 :离子霉素处理组激活率显著高于乙醇和A2 3187处理组 (89.6 %vs 6 3.5 % ,6 8.7% ;P <0 .0 5 ) ;离子霉素 +6 -DMAP处理组激活率显著高于离子霉素 +CHX和离子霉素 +CHX +细胞松弛素D处理组 (90 .1%vs 5 8.9% ,6 3.7% ;P <0 .0 1) ;体外成熟 2 4、2 6、2 8h组桑椹胚率分别为 16 .0 %、2 0 .6 %和 33.3% ,30h组桑椹胚率下降 (13.8% )。以上结果说明 ,在本研究的激活条件下 ,山羊卵母细胞适宜的激活方法为 :成熟起始后 2 8h使用离子霉素和 6 DMAP进行联合激活。     

免疫激活与抗菌药物调节研究进展

免疫激活主要通过多种细胞因子影响动物食欲和促进机体蛋白质及糖类分解,降低动物的生长性能。抗菌药物可调节免疫细胞活性,影响机体免疫激活状态。现有的研究提示,在应用抗菌药时除应注意考虑其在体内的药效外,还应考虑其免疫调节作用,以维护动物健康,促进动物生长。     

黄酮类化合物抑制小胶质细胞活化的构效关系研究

探讨系列黄酮类化合物抑制脂多糖(LPS)诱导的原代大鼠小胶质细胞激活的构效关系。采用MTT分析法检测细胞存活率;Griess法测定LPS激活的小胶质细胞NO释放的变化。在0.3～30μM浓度范围内,8种黄酮类化合物与LPS联合应用对小胶质细胞存活率无显著影响;黄酮、白杨素、芹菜配基、汉黄芩素、四羟黄酮5种黄酮类化合物可显著抑制LPS激活的小胶质细胞NO产生,而二羟黄酮类3种化合物(二羟黄酮、柚皮素、儿茶素)对细胞NO无显著抑制作用。黄酮类化合物母核结构中C-23,双键可能对抑制小胶质细胞激活很重要,其抑制作用的强弱取决于分子的取代类型。     

新农药硫肟醚的水解研究

硫肟醚[O-(3-苯氧苄基)-2-甲硫基-1-(4-氯苯基)丙基酮肟醚]是具有我国自主知识产权的一种新型杀虫剂品种,主要用于防治蔬菜和茶树害虫。报道了硫肟醚在不同pH值和温度下的水解动态及其机理。结果表明,硫肟醚在缓冲溶液中的水解反应比较缓慢,其水解反应速率随反应介质pH值的增大而稍有增加。在25℃时其在pH5、7和9的缓冲液中的水解半衰期分别为1257、879和492d,说明硫肟醚在水体中较稳定,不易分解,但总的趋势是在碱性条件下的水解速率较中性和酸性条件下快。硫肟醚在水体中的水解速率随温度升高而加快,在温度为15、25、35、45℃的pH7缓冲液中的水解半衰期分别为1092、879、490和399d,温度效应系数Q为1.23～1.8。硫肟醚水解反应的活化能与温度之间无明显相关性,其平均活化能和活化焓均较小,分别为28.13kJ·mol-1和25.58kJ·mol-1。而硫肟醚水解反应的活化熵绝对值随温度升高而增加,表现出显著的相关性,其平均活化熵为-219.97kJ·mol-1·K-1,表明硫肟醚在水溶液中的水化学降解主要是由反应的活化熵所驱动的。采用制备HPLC和LC-MS技术对硫肟醚水解产物进行分离和鉴定,初步确定硫肟醚分子在水溶液中生成的水解产物主要有1-(4-氯苯基)-2-(甲基磺酰基)丙烷-1-亚胺、2-甲硫基-1-(4-氯苯基)丙胺、1-(4-氯苯基)-2-(甲基磺酰基)丙基-1-酮肟醚、O-(3-苯氧苄基)-1-(4-氯苯基)丙基酮肟醚和硫肟醚亚砜等,推测硫肟醚的主要水解途径有肟醚键断裂、硫醚氧化和S-脱甲硫基作用等。     

猪卵母细胞电激活参数的研究

以体外成熟的猪卵母细胞为对象,研究不同卵龄、电场强度、脉冲次数和激活液Ca ,Mg 对猪卵母细胞电激活效果的影响.结果表明,1次脉冲就足以激活猪卵母细胞,电场强度以1 250～1500V/cm为优,含Ca ,Mg 的激活液激活效果显著高于非电解质液,卵龄以54h为宜.     

粉煤灰活化试验研究

就粉煤灰机械化学活化前后的表观特征、需水量比、粉煤灰水泥胶砂强度作了对比研究 .结果表明 :粉煤灰活化效果明显 ,活化粉煤灰水泥胶砂 3 d强度比活化前提高 10 .7% ,2 8d强度提高 15 .5 % .活化粉煤灰可以用作水泥混合材     

猪卵母细胞孤雌激活的研究

从卵母细胞孤雌激活的机制及影响因素,猪卵母细胞的激活,猪孤雌胚死亡主要原因,提高卵母细胞孤雌激活效果的技术途径,以及对孤雌激活的研究意义和发展前景等方面,对猪卵母细胞孤雌激活研究进行了综述.