新兴猪IL-18成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登录的猪白细胞介素18(pIL-18)基因序列，设计了1对特异引物。利用RT-PCR对从3周龄新兴仔猪脾细胞中提取的总RNA进行了扩增，获得了约500bp的片段。将该片段克隆、鉴定、测序，证实已获得了新兴猪IL-18成熟蛋白基因片段，其大小为474bp，编码157个氨基酸，与GenBank上登录的猪IL-18成熟蛋白基因序列完全一致。     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN—α基因序列设计了1对引物，应用PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约500bp的基因片段；将该片段克隆到pMD 18-T载体，经PCR、酶切及序列测定，该克隆片段由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸，与NCBI GenBank上登录的2个猪IFN—α基因序列(登录号为M28623和X57191)比较，核苷酸的同源性分别为99．4％和99．2％。     

广西巴马小型猪血清淀粉样P物质基因cDNA的克隆及序列分析

为了研究SAP基因的结构特点,进一步构建广西巴马小型猪SAP基因相关疾病模型,试验根据GenBank上发表的猪SAP基因序列的保守性设计引物,以广西巴马小型猪血液为材料,进行RT-PCR扩增、连接、转化、测序和分析.结果表明:获得的SAP基因cDNA片段长度为928 bp;广西巴马小型猪SAP基因与普通猪和人类分别有9...     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物，采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因，序列分析结果表明，所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678bp、编码226个氨基酸的前体蛋白，其核苷酸序列的同源性为99．79％以上，发现了4个核苷酸多态性位点，无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较，与猫（AF003087，96．7％）和绵羊（96．2％）的氨基酸同源性最高。     

猪ICOS基因部分cDNA的克隆与序列分析

研究旨在对猪T细胞诱导型刺激物(ICOS)基因的cDNA序列进行克隆与分析。根据已报道的人ICOS基因cDNA序列设计引物,首次从猪脾脏组织总RNA中扩增出ICOS基因编码区全长cDNA序列,克隆于pMD18-T载体后进行测序并进行序列拼接,运用生物信息学分析DNA序列。结果表明:该基因编码区全长630bp,编码210个氨基酸,包含5个外显子。该序列与人全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为80%和85%;与狗和小鼠的推导氨基酸序列的同源性分别为81%和75%。这为进一步研究该基因的结构特点和功能奠定了良好基础。     

猪IFN-γ基因的克隆与序列分析

猪IFN-γ具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，作为生物药荆和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT—PCR技术成功克隆了猪IFN-γ基因。序列分析表明，克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。该基因的成功克隆为IFN-γ的进一步研究和开发奠定了基础。     

弓形虫529 bp基因的克隆及序列分析

本研究对安徽猪源弓形虫529 bp重复序列进行了分析,为其分子流行病学研究以及诊断方法的建立奠定基础。首先对病料虫体基因组DNA进行提取,然后对弓形虫529 bp基因进行PCR扩增、克隆、测序并对测序结果进行比对、同源性分析和构建系统进化树。结果显示,PCR扩增产物约为528 bp,与已报道的弓形虫同一基因序列具有高度同源性,与GenBank报道的EF648169.1株同源性最高,达99.5%,且遗传距离最为接近;与其他5株猪源弓形虫比对显示主要突变区域在第31～74位和第100～141位碱基。表明该猪源弓形虫与犬源弓形虫EF648169.1株为姊妹株;本基因序列碱基突变较少,保守性较好,适合作为弓形虫病诊断的靶基因。     

转人血清白蛋白基因猪的表达分析

整合有人血清白蛋白基因的转基因猪 ,经琼脂糖扩散、蛋白质电泳、Western杂交等分析 ,发现 3头转基因猪不同程度地表达了人血清白蛋白 ,其中最高表达水平为 2 0 3mg/mL。     

猪ESR基因一个外显子片段的克隆与序列分析

参考人、鸡、鼠的ESR基因序列，设计一对引物，采用PCR技术扩增出猪ESR基因一段DNA片段，将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR扩增和酶切分析进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。将测定的猪ESR基因的部分序列（332bp)与人、鼠、鸡的序列进行比较，结果表明：猪的核苷酸和氨基酸序列与人、鼠、鸡相比，同源性分别为90．06％和86．36％，85．54％和88．18％，74．10％和71．82％，显示了强的保守性，猪的核苷酸序列与人、鼠、鸡相比存在着4处特有变异，氨基酸序列aa25-30存在高变异区。     

母猪VEGF基因mRNA全序列的克隆与分析

本研究运用多种分子生物学方法对母猪胎盘VEGF mRNA全序列进行克隆和分析,结果发现:母猪胎盘VEGFmRNA全长约3500 bp,其完整的cDNA编码190个氨基酸,通过同源性比较预测了VEGF基因的DNA序列全长约为16kb。VEGF基因编码的氨基酸序列与人、小鼠和恒河猴的同源性分别为78.82%、79.44%和96.34%。经生物信息学分析,预测VEGF蛋白理论分子量为22.33 kD,其等电点为7.89;大约在1~20,40~45,50~60,65~80,100~105位之间的氨基酸存在疏水性区域,用TMHMM2.0分析猪VEGF的跨膜结构发现此蛋白所有氨基酸都位于膜表面,证实了VEGF是一种表面蛋白。用signalP 3.0分析发现在1~27位氨基酸可能为信号肽(P=0.999),且可能在26和27位氨基酸之间发生切割(P=0.956)。对VEGF核苷酸序列和氨基酸序列、蛋白质结构和功能的分析,进一步证实本研究得到了VEGF基因mRNA的全序列,为VEGF基因与母猪繁殖性能的关联性研究提供依据。     

杜大长猪IGF-I基因的克隆及其序列分析

采用ＴＲＩzol法从杜大长杂交猪的肝脏中提出总ＲＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板 ,以设计的Ｐ１（５′－ＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣ－３′）为引物合成ＩＧＦ－Ｉ基因cＤＮＡ的第１链,再以Ｐ１和Ｐ２（５′－ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴ－３′）为引物扩增到大小约为３６０bp的产和,并将其达隆至pＧＥＭ－Ｔ载体上。经筛选、酶切、我分析,表明该片段为ＩＧＦ－Ｉ基因的cＤＮＡ     

猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因cDNA序列，分别从第1、第2和第3外显子中设计引物，以大约克猪染色体DNA为模板，分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到pGEM-easyT载体中，然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素因序列，共获得6kb连续序列。分析结果表明，猪肌生成抑制素基因第1内含子长1809bp，第2外显子长374bp，第2内含子长1978bp。所测得的外显子序列与已发表的cDNA序列同源分析比较，没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪（大约克猪）肌生成抑制素基因仍很完整，可通过改变基因结构等降低肌生成抑制素活性的方法提高瘦肉率。     

猪嵴病毒VP0基因的克隆与序列分析

本研究根据猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)VP0基因序列特征设计特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒VP0基因全长编码区。将特异性扩增目的片段克隆后进行序列测定,将结果进行拼接后获得猪嵴病毒VP0基因全长并进行相关生物信息学分析。所扩增的目的片段编码有完整的VP0基因开放阅读框,全长为1 098 bp,编码有366个氨基酸,理论等电点为6.71,理论分子质量为38.489 ku,不稳定系数为34.65,最大疏水指数为2.622,最小疏水指数为-2.122。将获得的VP0基因和GenBank中的猪嵴病毒代表株VP0基因序列进行核苷酸同源性比对和遗传进化分析,其与HNXX-4核苷酸同源性最高,为89.1%,与S-1-HUN核苷酸同源性最低,为81.1%。从遗传进化上看,猪嵴病毒VP0基因在遗传进化上呈两个独立的基因亚群,猪嵴病毒中国分离株在两个遗传基因亚群上均有分布。     

Cloning and Sequence Analysis of the VP0 Gene of Porcine Kobuvirus

In this study, specific primers were designed according to VP0 gene of porcine kobuvirus (PKV), and the full-length coding region of VP0 gene was amplified by RT-PCR method and sequenced, then bioinformatics analysis were conducted to investigate the structure and function of the porcine kubovirus VP0 gene.The results showed that the porcine kobuvirus VP0 gene was 1 098 bp in length, coding an open reading frame (ORF) with 366 amino acids.The isoelectric point, molecular weight and instability index of porcine kubovirus VP0 were 6.71, 38.489 ku, 34.65, respectively.The maximum and minimum hydrophobicity were 2.622 and —2.122, respectively.Compared with the porcine kubovirus VP0 genes published previously in GenBank, the sequenced gene shared the highest homology with HNXX-4 strain, which was 89.1%;And shared the lowest homology with S-1-HUN strain, which was 81.1%.The porcine kubovirus VP0 gene shared two different phylogenetic genotype branches, and the Chinese porcine kubovirus isolates distributed in the two phylogenetic genotype branches.     

猪新基因NPM1的克隆、序列分析与染色体定位

克隆了猪NPM1基因的cDNA和第4内含子序列，并利用生物信息学方法进行验证。所得cDNA序列全长1195bp且包含一个完整的开放阅读框，编码294个氨基酸。内含子序列长300bp，遵循GT／AG剪接法则。序列分析表明，该基因与已报道的人、大鼠和小鼠等物种的NPM1基因高度同源，氨基酸序列同源性分别为95％、91％和91％。该基因编码的蛋白具有Nucleoplasmin保守功能域。用体细胞杂种板将该基因定位在猪16号染色体q21区段，辐射杂种板定位结果表明该基因与猪16号染色体上SW977标记紧密连锁。     

猪细小病毒L株VP2基因片段的克隆及序列分析

对自行分离的PPVL株VP2基因片段进行克隆和测序。序列分析表明:L株VP2基因片段与其他PPV毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99.19%以上,氨基酸同源性在98.87%以上。表明L株与国内流行毒株之间同源性极为接近,其中与NADL-2(4973)株的亲缘关系最近(核苷酸同源性为99.81%,氨基酸同源性为99.62%)。在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),L株与NADL-2株相同,据此推测L株的毒性与组织嗜性可能与NADL-2相似。     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1（Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1）的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息,本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因,应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示,ROCK1基因有2个转录本,包含4 065 bp的开放阅读框（ORF）,编码1 354个氨基酸;猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%,相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%,该蛋白在不同物种间高度保守;ROCK1基因的组织分布较广泛,不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化;胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪（P < 0.01）,出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异（P > 0.05）。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

猪巨细胞病毒(PCMV)四川株gB基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的核苷酸序列(GenBank登录号:FJ870563.1)设计1对引物,采用PCR方法从确诊为猪巨细胞病毒的阳性样品中扩增gB基因,将其克隆到pMD19-T载体上,转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒T-PCMV-gB,经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上gB相应序列进行同源性分析。结果表明,该基因片段长度为2580 bp,与其他参考株gB基因的核苷酸同源性达98.0%～99.6%;其推导的氨基酸序列与人疱疹病毒6型和7型比较分析结果显示,其同源性分别为42.9%～43.6%和40.5%～40.6%。这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。     

6株猪流行性腹泻病毒N基因的克隆与分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,采用胶体金试纸条检测安徽省境内发生疑似猪流行性腹泻病的病猪粪便（2013—2017年）;对PEDV抗原阳性猪样品,利用RT-PCR方法扩增其PEDV N基因,并进行测序和序列分析。结果发现,经胶体金试纸条检测确认了6个猪流行性腹泻发病猪场;对来自该6个猪场的病料样品或病毒传代培养物进行RT-PCR扩增和测序,共获得6株PEDV流行毒株的N基因序列,其序列全长均为1 326 bp,将其分别命名为N12、N22、N32、N42、N52和N62。核苷酸同源性分析显示,6株PEDV分离株N基因之间序列同源性为94.8%~99.8%。其中,5株PEDV分离株（N12、N22、N32、N52和N62）与PEDV疫苗株、经典毒株、2011年之前的我国分离株（LZC、CHS）的同源性较低（94.1%~96.3%）,亲缘关系较远;与2011年后国内外PEDV分离株存在较高同源性（96.9%~99.2%）,亲缘关系较近;而N42正好相反。该研究表明,近年来安徽各地猪场以PEDV新变异毒株的流行为主。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。