梨属植物RAPD反应体系的建立与优化

以鸭梨、杜梨为材料,对梨属植物DNA的提取及RAPD反应体系进行了系统优化,建立了梨属植物最佳反应体系及参数。结果表明,适当提高抗氧化、抗酚类物质的浓度(2%β-巯基乙醇,2%PVP-40,20 mmol/LNa2S2O5),提取的基因组DNA纯度较高;反应体系中含有Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物0.4μmol/L,模板DNA 1.6 ng/μL,Taq DNA聚合酶0.06 U/μL,可成功用于梨属植物RAPD扩增。说明改良的CTAB法能成功用于梨属植物DNA提取,建立的最佳反应体系可用于梨属植物RAPD扩增。     

鼠尾草属植物基因组DNA提取及RAPD反应条件优化

以鼠尾草属植物叶片为材料,提取基因组DNA,并对RAPD反应条件进行了系统优化.结果表明,采用核DNA法提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析;RAPD扩增最佳反应体系为20μl反应体系中,10×buffer 2.0μl,模板DNA 20 ng,Mg 浓度2.0 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,dNTPs浓度0.2mmol/L,Taq酶1.0U.扩增反应程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1main,72℃延伸2main;40个循环;72℃后延伸10main,4℃保存.     

蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

结球甘蓝RAPD反应条件的优化

以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)基因组DNA为模板,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,优化了甘蓝的RAPD反应体系,调整了扩增程序.该体系反应总体积为20μL,其中25mmol/L MgCl2 2.0μL,10×PCR Buffer 2.0μL,10mmol/L dNTP 0.5μL,5U/μL Taq E 0.5μL,20ng/μL Primer 1.5μL,10ng/μL模板DNA 3μL,灭菌双蒸水10.5μL.适宜的扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,37℃复性1min,72℃延伸1.5min,40个循环;72℃延伸10min后15℃保存.     

当归RAPD反应条件的优化

以当归DNA为模板,对影响当归RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立当归RAPD反应的最适体系。通过正交法及单因素试验对RAPD反应条件进行优化,7个试验因子的最适条件为:模板DNA 0.5 ng/μL,引物0.8μmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,MgCl22.5 mmol/L,Taq酶0.8 U,退火温度36~37℃,循环次数40。     

西瓜枯萎病菌最优RAPD体系的建立

采用完全随机试验,对适合西瓜枯萎病菌的最优RAPD体系(包括随机引物浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及扩增反应中的退火温度)进行了探索,寻求各因素间的最优组合,最终得到了条带清晰的最优RAPD体系。反应体积为25μL,其中随机引物浓度为10μmol／L,Taq DNA聚合酶为1．25U,模板DNA度为1．6md/L,dNTPs浓度为2mmol／μL,扩增反应的退火温度为37℃。     

蝴蝶兰RAPD反应体系的建立

为建立一个稳定的蝴蝶兰RAPD反应体系,对RAPD反应体系中模板DNA、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2+浓度和dNTPs浓度等各项参数进行筛选比较。结果表明,最佳反应体系为:25μl反应体系中,其中含模板DNA(20 ng/μl)1.5μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.4μl,随机引物(20μmol/L)1μl,Mg2+(25 mmol/L)2.5μl,dNTPs(10 mmol/L)0.5μl,10×PCR Buffer2.5μl,ddH2O 16μl。     

大白菜RAPD反应条件的优化

RAPD是作物主要农艺性状分子标记及遗传多样性研究的一项重要技术。为了适应大白菜反应体系,本试验以大白菜品种413、96及其F1为试材,对影响RAPD扩增的模板DNA用量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度等因素进行了优化,结果如下:20μl PCR反应体系,30 ng(1.5μl)DNA模板,3 mmol/L Mg2+,0.01 U/μl Taq DNA聚合酶,0.4 mmol/L dNTPs,0.8μmol/L引物为最佳反应浓度。     

不结球白菜RAPD反应体系的优化

对影响RAPD扩增的各个因子,如TaqE,dNTP和Mg2+的浓度,模板DNA的浓度与纯度等进行研究,建立并优化了适于不结球白菜的RAPD反应体系:dNTP(0.19mmol/L)+Mg2+(1.95mmol/L)+TaqE(1U)+DNA(25ng/μL)+TM(50μmol/L)+甘油(φ=50%)+Primer(0.24μmol/L)+10×Buffer+H2O,总反应体系为25μL。     

毁灭炭疽菌RAPD和ISSR-PCR最佳反应体系的建立

对影响PCR反应的主要因子-Md2+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化,建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系.RAPD反应体系(25μL):Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Taq酶用量为1U,引物浓度1μmol/L.ISSR反应体系(25μL)为:Mg2+浓度为2 mmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,Taq酶用量为0.5 U,引物浓度为1.25 μmol/L.     

菟丝子RAPD反应体系的建立和优化

以南方菟丝子基因组DNA为试材,采用单因素递进筛选方法对菟丝子的RAPD反应体系进行了优化。结果表明,在25μL总反应体积中,最佳浓度配比为：模板DNA 20 ng,MgC l23.0 mmoL/L,引物10μmoL/L,dNTP 400μmoL/L,TaqDNA聚合酶1个单位（U）,10×反应缓冲液2.5μL。扩增程序为：94℃变性3 m in,再进入循环;94℃变性1 m in,40℃退火1m in,72℃延伸1 m in,共40个循环;72℃最终延伸10 m in,于4℃保存。     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

长白山林下参基因组DNA提取及RAPD体系的优化

采用改良的CTAB法提取林下参的基因组DNA,所得的DNA纯度高、质量好,可用于RAPD分析．筛选出的林下参RAPD反应的最佳体系为20“L,反应体系中包括模板DNA20ng,引物20pmol,dNTPs0．1875mmol／L,TaqDNA聚合酶1．5U,Mg^2＋2．0mmol／L,10×Reaction Buffer2．0mmol／L,其余部分用无菌超纯水补充．PCR扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,37℃退火1min,72℃延伸2min,40次循环,72℃最终延伸7min．应用优化后的反应体系PCR扩增获得的RAPD指纹图谱带型清晰,重复性好,为通过分子标记获得丰富的林下参遗传信息奠定了基础．     

椰子基因组DNA的提取及RAPD反应体系的优化

以椰子叶片为实验材料,探索了椰子基因组DNA的提取方法,并对影响RAPD反应的各因素进行了优化,建立了椰子的优化反应体系和程序。试验最终建立的椰子RAPD反应总体积为20μL,各有关成分的最佳浓度分别为Mg2＋2.5 mmol/L,Taq DNA0.75 U,dNTP 0.2 mmol/L,Primer 1μmol/μL,模板DNA2.5 ng/μL。PCR循环程序为：94℃预变性1.5min;94℃变性20 s,36℃退火20 s,72℃延伸45 s,35个循环;最后72℃延伸3 min。     

石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的优化

[目的]研究石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的建立和优化。[方法]以石鲽为试材,按常规酚/氯仿抽提法提取其基因组的DNA,对影响RAPD反应的各因素进行优化,建立了石鲽的最佳RAPD反应体系和程序。[结果]采用常规酚/氯仿抽提法获得的DNA完全能够满足RAPD分析的要求。通过优化建立一套适合石鲽的稳定的RAPD反应体系:反应体系总体积为25μl,包括10×buff-er2.5μl,MgCl22 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.2μmol/L,模板30 ng,Taq酶1 U。扩增程序为:94℃预变性5 min,45次PCR循环(94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min和72℃延伸10 min。利用该体系对OPK和OPV系列共40条引物进行扩增,发现其中部分引物能产生稳定、清晰的条带。[结论]该体系为石鲽遗传多样性以及相关分子标记的研究奠定了基础。     

文冠果DNA提取及RAPD反应体系的优化

以山西省20个县的文冠果为材料,采用改良的CTAB法提取文冠果基因组DNA,并对文冠果RAPD分析的最佳反应体系进行优化。结果表明,文冠果RAPD分析的最适反应体系为:PCR扩增的总体积为20μL,包括30ng的模板DNA,10×PCR buffer 2μL,2.0mmol.L-1 Mg2+,0.1mmol.L-1dNTP,Taq酶1U,不足的体积用超纯水补足。扩增程序为:94℃预变性120s,94℃变性30s,36.9℃退火45s,72℃延伸90s,45个循环后在72℃延伸300s,结束后在4℃条件下保存。在此最佳反应条件下,RAPD分析具有良好的稳定性和可重复性。     

火棘基因组DNA的提取和RAPD稳定的反应体系的建立

[目的]研究提取火棘基因组DNA的最佳方法,并研究适合火棘的稳定的RAPD反应体系,为以后开展火棘的遗传多样性研究、物种资源研究和亲缘关系鉴定等提供重要的参考。[方法]采用改进的CTAB法,成功地提取了火棘基因组DNA,并对RAPD反应体系中的Taxi酶、MgCl2、dNTPs和引物4个因素进行4因素4水平的正交试验设计,从中筛选出最佳的优化条件。[结果]电泳结果显示,DNA无降解,杂质少。DNA浓度较高约为500ng／μl。并以此DNA为模板,成功地建立了RAPD稳定的反应体系：总体积25山,包括25ng的DNA,1×buffer,2．3mmol／LMgCl2,1．0μmol／L引物,O．15mmol／LdNTPs和2．0U的TaqDNA聚合酶。RAPD扩增程序为：先在94℃下变性4min,然后在94℃下变性40s,36．8℃下复性50s,72℃下延伸70s,反应40个循环,最后72℃延伸4min。[结论]改进的CTAB法能成功地提取火棘基因组DNA,利用正交试验设计所建立的RAPD反应体系,可以获得较为稳定、可靠的扩增产物。该体系可应用于火棘遗传多样性、亲缘关系等方面的研究中,为进一步开展火棘分子生物学研究奠定了基础。     

茄子RAPD分子标记体系的建立与优化

采用改良的CTAB法提取茄子基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,建立了茄子RAPD-PCR的最佳反应体系:20μL反应体系其中含25 mmol/L MgCl2 2.0μL1、0×PCR Buffer 2.0μL、10mmol/L dNTP 0.5μL5、U/μL Taq E 0.2μL0、.1μmol/L Primer 3μL1、0 ng/L模板DNA 3μL、灭菌双蒸水9.3μL。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,37℃退火1 min7,2℃延伸1.5 min4,5个循环;72℃延伸10 min后4℃保存。     

木豆随机扩增多态性DNA的反应体系研究

[目的]分析影响木豆RAPD-PCR反应中的主要因素,优化反应条件。[方法]以木豆品种ICPL87091为试材,以木豆基因组DNA为模板,通过对PCR反应体系中各种参数的优化设置,分析比较各种因素对RAPD扩增结果的影响,建立适宜的反应体系。[结果]试验得到了较为理想的适宜木豆的反应体系。优化的木豆RAPD反应条件为:模板DNA浓度30 ng,随机引物1.6μmol/L,dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)各0.2 mmol/L,Mg2+浓度2.0 mmol/L,Taq酶1.0 U,反应体积为25μl。循环体系为:先94℃1 min,35℃2 min,72℃2 min,5个循环;然后94℃30 s,37℃1 min,72℃1 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]利用这一反应体系可有效地进行木豆随机扩增多态性DNA分析,极大地提高了实验结果的可重复性。     

天麻PCR反应体系的建立

 通过对Mg²⁺,dNTP,随机引物、模板DNA,TaqDNA聚合酶浓度等反应参数的系统研究,建立了天麻RAPD分析体系。该体系反应总体积20 μL, 其中MgCl₂ 2.5 mmol/L, dNTP 0.25 mmol/L,模板20 ng,随机引物0.3 μmol/L,Taq酶1.5 U. 反应程序为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性35 s,36 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,40个循环,最后72 ℃延伸5 min. 结果表明该体系具有良好的稳定性和重复性,可应用于天麻的演化、系统分类、品种鉴定等研究。