可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）,解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因（polh）表达盒和EoNPV的解旋酶基因（hel）表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。     

家蚕miRNA对核型多角体病毒靶基因的预测

了解家蚕miRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的调控作用,为家蚕病毒的防控研究提供参考,利用已发布的563条家蚕成熟miRNA预测其在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中的靶基因,并利用在线靶基因预测软件RNAhybrid进行预测。结果表明:预测得到55个可能的靶基因,功能涉及家蚕体内病毒的复制增殖、病毒早期及晚期的转录和表达、抗家蚕细胞凋亡以及与病毒的结构蛋白相关等。miRNA与病毒的相互作用存在于病毒的侵染到释放的整个过程中,可能是一种重要的调控方式。     

家蚕中肠组织感染质型多角体病毒的应答基因分析

 【目的】筛选家蚕（Bombyx mori）中肠感染质型多角体病毒的应答基因,为阐明家蚕感染质型多角体病的分子机制奠定基础。【方法】 应用含有约23 000个家蚕基因组寡核苷酸芯片比较分析感染家蚕质型多角体病毒24、48及72 h的中肠试验组与中肠对照组的差异表达基因;结合生物信息学工具对差异表达基因的功能注释、分类及涉及的信号通路等进行分析;应用实时荧光定量PCR验证17个基因的差异表达。【结果】 在感染24、48及72 h后,分别得到了9、51及258个差异表达基因。KEGG通路分析表明,在感染48及72 h后,大多数涉及到代谢通路的基因的表达水平下调,所有涉及到核糖体通路和蛋白酶体通路的基因的表达水平上调。一些免疫相关基因如丝氨酸蛋白酶抑制剂、脂酶、热激蛋白、细胞色素P450、核糖体P0蛋白等基因的表达水平上调。【结论】经荧光定量PCR验证的差异表达基因可能与家蚕感染质型多角体病毒的应答机制相关,研究结果为从分子水平上阐明家蚕感染质型多角体病毒的致病机理提供了新的研究方向。     

家蚕核型多角体病毒IE1的多克隆抗体制备及鉴定

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)ie1 基因是BmNPVDNA复制的必需基因,其编码的IE1蛋白能够反式转录 激活杆状病毒早期基因的表达.为了进一步研究IE1蛋白在家蚕核型多角体病毒感染宿主过程中具体的功能,研究 通过PCR扩增BmNPVie1 基因片段,亚克隆到原核表达载体pET32,获得重组质粒pET32-IE1,经测序正确后, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株.通过IPTG诱导融合蛋白原核表达后,初步纯化收集抗原,免疫新西兰大白 兔,制备IE1多克隆抗体.应用制备的免疫兔血清进行Western-blot分析,结果显示多克隆抗体能特异识别BmNPV 的IE1和IE0蛋白.免疫荧光结果同样显示IE1蛋白定位于宿主细胞核病毒复制中心.IE1抗体制备的成功为进 一步研究IE1在病毒感染家蚕中的作用机理奠定了基础.     

一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中分别克隆出其P10基因。从BmNPV P10中亚克隆得到其5′端上游片段,经PCR定位突变使之ATG区突变成一个BglⅡ酶切位点。从AcMNPVP 10中亚克隆得到基因3′端下游片段,克隆入经突变的BmNPV P10基因启动子的下游,构建成一个新的转移表达载体pBmAcPV-1,由于BmNPV和AcMNPV P10基因及两端的同源性高达90％以上,该载体可以分别与野生型BmNPV和AcMN-PV DNA进行同源重组。     

家蚕核型多角体病毒ie-2基因dsRNA表达载体的构建

为了研究ie-2基因的dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果,根据NCBI公布的BmNPV(T3株)基因组序列,克隆了BmNPV极早期表达因子ie-2.将该基因用亚克隆的方法导入到L4440载体中构建L4440-ie-2,并成功转入大肠杆菌HT115(DE3).IPTG诱导可以成功表达相应的dsRNA.     

豆天蛾核型多角体病毒和雀纹天蛾核型多角体病毒光解酶基因的功能鉴定

为研究豆天蛾核型多角体病毒(Clbi NPV)和雀纹天蛾核型多角体病毒(Thja NPV)的光解酶是否具有修复由紫外线辐射引起的DNA损伤的功能,本试验分析了2种光解酶基因对大肠杆菌和家蚕(Bm)细胞抵御紫外线能力的影响。结果显示,来源于Thja NPV的野生型光解酶基因(Thjaphr)的表达显著提高了大肠杆菌的光修复能力,而来源于Clbi NPV的突变型光解酶基因(Clbiphr)没有光修复功能。在紫外线处理的Bm细胞中,野生型及突变型光解酶基因均没有表现出光修复活性。亚细胞定位结果显示,Thjaphr及Clbi NPV光解酶基因大的开放阅读框(Clbiphr2)定位于家蚕细胞的细胞核,小的开放阅读框(Clbiphr1)仅在细胞质中积累。     

快速敲除补回家蚕核型多角体病毒ORF29

利用Red重组系统成功敲除家蚕核型多角体病毒ORF29基因（BmNPV ORF29,简称Bm29）,并利用Bac to Bac系统构建补回型的Bm29基因。通过PCR鉴定敲除和补回均成功,为后续的Bm29基因功能研究奠定基础。     

家蚕微孢子虫SWP25基因BmN细胞表达质粒的构建及表达

本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。     

一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒中分别克隆出其Ｐ１０基因。从ＢｍＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基５端上游片段，经ＰＣＲ定位突变使之ＡＴＧ区突变成一个Ｂｇ１Ⅱ酶切位点。从ＡｃＭＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基因３端下游片段，克隆人经突变的ＢｍＮＰＶＰ１０基因启动子的下游，构建成一个新的转移表达载体ｐＢｍＡｃＰＶ－１，由于ＢｍＮＰＶ和ＡｃＭＮＰＶＰ１０基因及两端的同源性高达９０％以上，     

分子标记辅助构建同质同核近等基因恢复系L-Rf5

红莲型水稻恢复系9311中有2个红莲型恢复基因Rf5和Rf6,不育系YTA中有2个不育基因orfH79和orf216;为了研究2个恢复基因与2个不育基因之间的互作关系,将红莲型水稻不育系YTA与恢复系9311杂交,杂种后代再以YTA为轮回亲本回交8代;根据Rf5基因序列设计特异分子标记,并对L-Rf5进行检测,结合花粉镜检结果,筛选出只含Rf5的纯合株系,多代自交后其表型一致,说明纯合株系L-Rf5构建成功;对近等基因恢复系的不育基因orfH79和orf216的表达量进行分析,结果显示:L-Rf5中orfH79的表达量较YTA明显下降;纯合的L-Rf5比杂合的L-Rf5不育基因orfH79的表达量稍低;L-Rf5中orf216的表达量较YTA下降并不明显。同时克隆了YTA、9311、近等基因恢复系中Rf1B序列,发现它们之间没有差异。     

水稻HL-CMS细胞质雄性不育基因的体外转录及Northern Blot检测

[目的]通过基因克隆和体外转录技术获得水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)中的2个细胞质雄性不育基因orf216和orfH79的RNA,为Northern Blot检测提供阳性定量标准品,并可作为凝胶阻滞试验的底物,用于研究与恢复基因编码产物的相互作用,从而为阐释不育基因与恢复基因的相互作用分子机制奠定基础。[方法]以红莲型胞质雄性不育基因orf216和orfH79的特异引物,利用不育系YTA为材料,PCR扩增获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,补平粘性末端,以rN4为底物、用依赖于DNA的RNA聚合酶进行体外转录,转录产物用DNase处理除去DNA模板,纯化并测定RNA浓度,并用Northern Blot验证。[结果]获得了细胞质雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA,经检测orf216浓度为1.286μg/μl,A260/A280为2.01;orfH79浓度为1.006μg/μl,A260/A280为2.10。[结论]运用体外转录技术获得的RNA片段条带单一,纯度较高,可用于体外大量获取目的 RNA。     

生殖生长期烟草orf25基因的表达和ATP酶活性分析

为探讨烟草orf25基因与雄性不育性的关系,以处于生殖生长期的烟草雄性不育系MS革新3号及其保持系革新3号为研究材料,运用荧光定量技术测定orf25基因的表达量,同时测定ATP酶活性。结果表明,orf25基因在保持系不同器官中的表达量比不育系的相对较高,而在同一材料中,orf25基因在花器官中的表达量最高,叶片次之,根部表达量相对较低;ATP酶活性也是保持系的比不育系的相对较高,而在同一材料中,花器官中的ATP酶活性也最高,而叶与根之间则无显著差异。相关性分析表明,同一器官中orf25基因的表达量与ATP酶活性之间存在着极显著的正相关。     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

牦牛C1H21orf62基因的克隆、生物信息学及表达分析

应用RT-PCR方法克隆牦牛C1H21orf62基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR方法检测C1H21orf62基因在有角牦牛和无角牦牛角芽组织的mRNA表达.结果表明,C1H21orf62基因编码区全长662 bp,编码161个氨基酸.C1H21orf62是一种亲水性蛋白,含有13个潜在的磷酸化位点,但无跨膜域和信号肽.C1H21orf62基因mRNA在无角牦牛角芽组织的表达水平极显著高于有角牦牛.     

利用同框敲除技术研究Ⅲ型聚酮合酶基因orf18的代谢产物

为了阐明Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中Ⅲ型聚酮合酶基因orf18的功能,利用同源双交换的方法对该基因进行同框敲除,采用异位表达的方法进行了相应的回补实验。通过高效液相色谱及液相色谱-质谱联用分析发现基因orf18的敲除会明显降低发酵产物中苯甲酸盐的含量,回补该基因能够在一定程度上恢复苯甲酸盐的产量,表明orf18在原宿主中极有可能参与苯甲酸盐的生物合成。     

棉铃虫核型多角体病毒orf80多克隆抗体的制备

从HearNPV G4株基因组中克隆得到orf80基因的全序列,将该基因构建于pMAL-c4E载体并在TB1中融合表达,orf80融合表达蛋白分子质量为73.3ku,与预测的蛋白一致,Western blot验证正确。纯化融合蛋白后制备抗原并注射新西兰大白兔从而得到orf80的多克隆抗体,经ELISA检测其效价达到2.56×105,表明该抗体具有较高的免疫原性,可用于orf80编码蛋白的检测及蛋白互作等相关研究。     

羊口疮病毒在单层细胞上繁殖特性的研究

本文采用奶山羊睾丸细胞对羊口疮病毒的繁殖特性进行了研究。从来自皇城、灵台和阿沿沟牧场的病羊痂皮组织中分到HC、LT和AT三株口疮病毒。比较了吸附一、混合一、改进混合三种方法分离培养口疮病毒的效果。进一步选用第15代HC分离物分别测定了吸附时间、接种浓度同细胞致病作用(CPE)、以及病毒复制、CPE与培养时间的关系,对比了细胞毒与痂皮毒的理化特性。结果表明,1—10代CPE很不规则,且有显著的毒株差异,而10代以后CPE趋于稳定。病毒复制于感染后42小时达到高峰,效价为10~6TCID_50/0.2ml,50—60％CPE为其标指;芽生释放的病毒具有一层外膜结构。还发现具有2或3个核衣壳的病毒粒子。     

棉铃虫核型多角体病毒G4株Ha99蛋白的原核表达和orf99敲除回复子的构建

[目的]探索棉铃虫核型多角体病毒G4株Ha99蛋白的最佳表达条件。[方法]采用PCR从其基因组中扩增出orf99编码区,将其克隆到pGEM-Teasy载体,测序后将其亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,转化大肠杆菌BL21加入IPTG诱导融合表达。并在orf99缺失杆粒HaBac△99的基础上构建了orf99敲除子HaBac-KO99及回复子HaBac-Rep99。[结果]SDS-PAGE分析表明,GST-Ha99融合蛋白得到成功表达,Westernblot进一步分析表明融合蛋白已得到成功表达。此外,PCR及酶切验证各载体构建成功。[结论]为orf99功能的进一步研究奠定基础。     

羊口疮病毒F1L蛋白对山羊痘病毒黏附BHK21细胞的影响

以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板,用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列,并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析;优化合成059基因编码序列,连接载体pET42a(+),转化Escherichiacoli BL21(DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌,采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白,并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度;将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层,分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育,利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量,研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列,其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域,显示出肝素结合活性;该蛋白羧基端有2个跨膜区,不利于蛋白质的表达,但优化DNA序列构建的重组质粒菌,经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达;免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性;Bra...