大肠杆菌工程菌K12△dapA发酵产L-苏氨酸培养基的优化

对大肠杆菌工程菌株K12△dapA的摇瓶分批发酵条件进行了研究.采用正交设计.均匀设计等试验方法,应用SPSS数据处理系统和均匀设计试验方法和分析系统(MDAS)获得了该菌株种子培养基与发酵培养基优化配比,并对种子培养条件与发酵条件进行了研究.在优化条件下,大肠杆菌工程菌K12△dapA摇瓶分批发酵72 h.产L-苏氨酸达8.2 g,L,提高了1.2倍.     

L-苏氨酸的生产工艺

文章介绍了苏氨酸的理化性质,重点介绍了苏氨酸的不同生产工艺特点、工艺流程,影响生产工艺的因素,并展望了苏氨酸的市场前景。     

L-苏氨酸摇瓶发酵工艺的研究

采用L-苏氨酸基因工程菌FCD13进行摇瓶发酵工艺的研究,经研究表明,种子培养基配方对发酵有较大影响,最佳种子培养基配方为:蔗糖30.0(g/L)、碳酸钙35.0(g/L)、硫酸铵10.0(g/L)、磷酸二氢钾2.0(g/L)。最优的摇瓶发酵条件为:250mL三角瓶中装液量为20mL;接种量5%;摇床温度37℃;摇床转速240 r/min。     

L-苏氨酸产生菌的选育

[目的]为苏氨酸基因工程菌的构建和苏氨酸的工业化生产奠定基础。[方法]以谷氨酸棒杆菌为出发菌株,采用紫外线（UV）诱变和硫酸二乙酯（DES）复合诱变进行诱变处理并筛选出AHV抗性突变株。[结果]用细菌选择性平板选出产酸菌株266株,用纸层析法从中选出产苏氨酸菌株3株,其产苏氨酸量分别为0．18、0．12和0．08g／L。在AHV浓度为0、1．5和3．0g／L的平板上,菌株X1的菌落多且大;在AHV浓度为4．5g／L的平板上,其菌落少且小;在AHV浓度为6．0和7．5g／L的平板上仅有几个小菌落。传代试验表明只有菌株UV-3能稳定产酸,产量比出发菌株高55．6％。在AHV浓度为4．5、6．0和7．5g／L的平板上,菌株UV-3的菌落多且大;在AHV浓度为9．0g／L的平板上,其菌落少且小;在AHV浓度为10．5g／L的平板上仅有几个小菌落。[结论]该试验成功选育出了一株稳定、高产并具有AHV抗性的L-苏氨酸产生菌。     

亚硝基胍诱变选育L-苏氨酸高产菌的研究

为筛选出L-苏氨酸的高产菌,以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glu anicum)为出发菌,进行亚硝基胍(NTG)诱变处理选育试验.结果表明:筛选出蛋氨酸+赖氨酸+异亮氨酸缺陷型菌株Y-1(Met-+Lys-+Iso-),经摇瓶发酵72 h后,L-苏氨酸积累可达4.14 g/L.     

培养条件对大肠杆菌产L-天冬酰胺酶的影响

研究了培养温度、培养时间、初始pH值和摇床转速等培养条件对所选大肠杆菌（E.coli No TN1.5885）产L-天冬酰胺酶的影响。实验结果表明,该菌株进行摇瓶培养的最适培养条件为37℃下培养16h,初始pH值在7.0-7.5间,摇床转速约为300r／min。其比酶活力约为406U／g,比优化前大约提高了20％。     

L-苏氨酸发酵种子培养基及培养条件的优化

采用正交试验设计对菌株WS4006-7E-NUT-21 L-苏氨酸发酵的种子培养基进行优化,同时对影响种子生长的条件如种子培养时间、种子液初始pH值、种子装液量等进行了研究,最终确定了L-苏氨酸发酵的最优种子培养条件。确定了种子培养基的最佳组成为葡萄糖30 g/L、硫酸铵3 g/L、玉米浆40 g/L、酵母膏5 g/L;种子的最佳培养条件为250 mL的三角瓶中装液量25 mL,种子培养基的初始pH值7.0,培养时间16 h,接种量10%。     

rhtB基因过表达苏氨酸工程菌发酵过程的优化控制

[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1 g/L;以（NH4）2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2 g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为（NH4）2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。     

产低毒性脂多糖大肠杆菌J5基因重组株的构建

细菌脂多糖(LPS)对宿主细胞具有一定的毒性,但经修饰后的单磷酸类脂A(MPLA)却是一种无毒性的高效免疫佐剂。选择天然O抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株为出发菌株,利用λ-Red同源重组技术导入外源弗朗西斯菌(Francisella novicida)lpxE基因,缺失大肠杆菌lpxM基因。结果显示,J5ΔlacI::lpxEΔlpxM基因重组株的LPS鲎试剂活性较DH5α和J5原菌显著降低;对4周龄的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物,重组菌和PBS组的小鼠体征及肝脏切片均正常。同时,腹腔注射大肠杆菌J5和DH5α的小鼠被毛凌乱、精神抑郁、肝脏细胞肿大,发生炎性浸润,有明显的毒性反应。以上结果说明,J5重组菌的LPS已经区别于原菌,是低毒性的MPLA产物。上述重组株的成功构建,能为生产廉价的兽用MPLA免疫佐剂奠定工作基础。     

rhtB基因过表达苏氨酸工程菌发酵过程的优化控制(英文)

[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1g/L;以(NH4)2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为(NH4)2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。     

核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达

不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序. 该基因编码五功能的AROM蛋白. 为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5烯醇丙酮酰莽草酸-3磷酸合酶（EPSPS）,将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶（DHQS）和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E, 并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）或大肠杆菌JM109中表达. 酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX-E、pET-DE和pET-E的大肠杆菌BL21（DE3）转化子具有EPSPS的催化活性,说明核盘菌arom基因的这些DNA片段可以被单独表达. 核盘菌EPSPS异源表达系统的 建立为该酶的抑制剂设计奠定了基础.      

3株HPI+大肠杆菌fyuA与int基因的检测及序列分析

在耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的基因中,fyuA编码鼠疫菌素受体与细菌的摄铁能力调节有关,int编码的整合酶与HPI在大肠杆菌基因组αsn-tRNA位点的整合相关.根据GenBank中已发表的HPI基因序列设计2对引物,分别用于fyuA和int的PCR扩增.将从3株仔猪腹泻源HPI+大肠杆菌(S70903株、S70925株、S70931株)中扩增的片段克隆至pGEM-Teasy载体,分别获得含有fyuA和int的重组质粒.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明:所克隆的fyuA基因大小均为948 bp,与已发表序列的同源性为98.6%～100%.所克隆的int基因片段大小均为1 391 bp,与已发表序列的同源件为96.0%～99.6%.研究结果提示,这3株细菌的fyuA基因并没有因为HPI的转移而缺失或被修饰,并且均整合在大肠杆菌基因组口αsn-tRNA位点.     

大肠杆菌流行株耐药特性对其免疫效果的影响

经人工诱导不同耐药水平的菌株,改变其耐药特性,制成灭活制剂免疫小鼠,2周后分别用致死剂量的原菌株和24株同期分离菌株感染免疫小鼠,考察小鼠存活率。结果表明：“O”抗原相同的菌株免疫小鼠,耐药种类少且耐药水平较低的1号菌株对24株同期分离的致病性鸡大肠杆菌的保护率仅为31％,免疫后接受体外敏感药物环丙沙星（CIP）治疗保护率为34％。经体外诱导耐药后保护率无明显变化,但再给药治疗保护率明显提高,达到54％。而135号菌株对受试的11种抗生素耐受9种,且耐药水平较高,其培养物免疫小鼠后对致病大肠杆菌感染的保护率显著提高,达到67％,含有抗生素培养基培养的菌液免疫小鼠,保护率略高于普通培养时的保护率,达到72％。当使用体外不敏感药物CIP对免疫小鼠治疗时,其免疫保护率达到最高77％。但使用抑制剂抑制其耐药性后,保护率随之大幅下降,为37％。7号菌耐受6种抗生素耐药水平中等,无药培养后灭活物的保护率为54％,含药培养后灭活物的保护率为61％,体外不敏感药物在体内可以加强免疫保护作用,保护率达到79％。大肠杆菌流行菌株的耐药特性可能与其免疫学效果有关,多重耐药株对当前流行菌株具有更好的免疫保护作用,而且已耐受抗生素可加强免疫保护作用。     

鸡源大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)克隆

根据人源大肠杆菌１型菌毛结构基因ＤＮＡ序列,在其保守区设计了１对带有ＢａｍＨ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ酶切位点的引物,经ＰＣＲ扩增,从２４株鸡源大肠杆菌致病株染色体中得到２１个大小约６５７ｂｐ的阳性产物,经酶切、连接、转化及筛选,得到３种来自不同自清型鸡源大肠杆菌ＰＣＲ产物的阳性克隆。经核酸序列测定,确认所克隆的外源基因为１型菌毛ｐｉｌＡ基因。     

蚯蚓水解液对大肠杆菌的抑菌效果

对经4、5、6h水解的蚯蚓水解液进行离心和过滤2种处理,采用滤纸片法和打孔法测定蚯蚓水解液对大肠杆菌的抑菌效果.结果表明:经5h水解的蚯蚓水解液对大肠杆菌抑菌效果最好.     

大肠杆菌MetJ的基因修饰对其蛋氨酸产量的影响

采用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍基因突变法,得到大肠杆菌K-12的耐蛋氨酸类似物突变体。经过发酵测试,突变菌株获得1 020 mg/L的L-蛋氨酸产量。研究结果表明:L-蛋氨酸生物合成过程中的2个关键酶,即胱硫醚γ-合酶与胱硫醚β-裂解酶,在L-蛋氨酸发酵过程中未受到蛋氨酸的反馈阻遏。采用PCR方法对突变体的MetJ蛋白克隆并进行基因测序可知,野生型的第54位的丝氨酸基因被替换为天冬氨酰,使得反馈阻遏作用消除,从而有效提高L-蛋氨酸的发酵产量。     

产志贺毒素大肠杆菌毒素基因的敲除

根据GenBank上致仔猪水肿病大肠杆菌志贺毒素(Stx2e)A单位基因序列(M21534)以及Red重组系统试剂盒提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列设计1对引物;引物的5′端与Stx2e基因同源,3′端与FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列同源。使用合成的引物利用PCR扩增FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列片段。将扩增的PCR片段转化带有pRedET重组质粒的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)S451521菌株(F18+)的感受态细胞中,通过同源重组技术替换Stx2eA单位基因的805～1 152bp区域。通过卡那霉素抗性以及PCR检测获得同源重组的STEC后,将708-FLPe质粒进一步转化重组菌,利用Flp重组酶去除了重组菌的卡那霉素抗性。另外,研究还发现Stx2e基因在STEC基因组中并非单拷贝。     

O139, 142, 26混合血清型大肠杆菌的O-抗原基因簇的破译

应用鸟枪法扩增了一株从水肿病病死猪肠系膜淋巴结分离到的O混合血清型(O139,142,26)大肠杆菌的O-抗原基因,测序结果显示扩增的O-抗原基因长度为11 771 bp。通过生物信息学的方法对其结构进行分析,发现其具有10个开放阅读框架及功能基因种类。经与发表的大肠杆菌O139、O26和O142的O-抗原基因序列及O-抗原糖基链的结构进行比对,进化树分析,跨膜蛋白的结构分析以及对乳糖前体(Glc)添加乙酰基的机制分析,结果表明,该O混合血清型大肠杆菌的O-抗原基因与大肠杆菌O139的O-抗原基因进化关系最近。     

氮磷营养盐对大肠杆菌四环素耐药性的影响

根据临床和实验室标准协会（clinical and laboratory standards institute, CLSI）推荐的微量肉汤稀释法检测泥样中大肠杆菌对四环素的敏感性,并应用PCR法检测四环素耐药基因tetA,tetB,探讨氮磷营养盐对大肠杆菌四环素耐药性影响的可能机制。结果表明：添加不同剂量氮磷营养盐能够导致大肠杆菌对四环素产生耐药性,但大肠杆菌的耐药率与剂量间无明显相关性。37株高耐药率大肠杆菌tetA基因的阳性率为100%,66株低耐药率大肠杆菌tetA基因的阳性率为16.67%,而16株对药物敏感的大肠杆菌未检测到tetA基因;但供试大肠杆菌均未检测到tetB基因。这表明,氮磷营养盐诱导的大肠杆菌四环素耐药性与tetA基因有关。     

大肠杆菌otsA基因的克隆和转化本生烟草

海藻糖是一类重要的渗透调节剂,可以提高植物抵抗多种非生物胁迫的能力。6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是海藻糖生物合成的关键酶,在大肠杆菌中,ots A基因编码TPS。本试验通过PCR技术克隆ots A基因,构建p2300-ots A-GFP表达载体,用农杆菌介导的方法将ots A基因导入到本生烟草中。对筛选获得的转基因植株进行检测表明,ots A基因已成功整合到本生烟草的基因组中,并能进行有效转录。而且研究发现,转基因幼苗在含有150mmol/L Na Cl的培养基中能够生长,具有一定的抗盐胁迫能力。