番木瓜诱导型基因CpPGIP2启动子的克隆与分析

【目的】获得诱导型基因Cp PGIP2启动子,并分析该启动子的功能。【方法】以番木瓜Cp PGIP2基因c DNA序列(HQ660394)搜索番木瓜基因组DNA序列,获得一段约2 000 bp的5’端上游DNA序列(ABIM01005077),参照该序列设计PCR特异引物,以番木瓜叶片DNA为模板克隆该启动子,并进行生物信息学分析。将3个启动子片段替换p CAMBIA1301载体中的Ca MV 35S启动子,构建缺失启动子表达载体,以GUS瞬时表达检测缺失启动子表达活性。【结果】获得了Cp PGIP2起始密码子上游长为1 981 bp的调控序列,经分析该序列含有真菌、脱落酸、赤霉素、光照等多种响应元件,为诱导型启动子。构建了1个启动子全长表达载体和2个5’端缺失启动子表达载体,分别命名为p D0-1981、p D1-1204和p D2-261。启动子在番木瓜果肉中的瞬时表达显示,长度为1 204 bp的启动子表达活性最强。并且,该启动子在根、茎、叶、果肉和愈伤组织中均有不同程度的表达,在近外果皮的果肉处和根部表达最明显。【结论】本研究获得了Cp PGIP2启动子序列,确定了表达活性最强的启动子长度,初步分析了启动子的表达模式和顺式作用元件,为进一步深入研究Cp PGIP2基因功能以及将该启动子应用于植物基因工程育种奠定了基础。     

番木瓜主要品种特性及栽培技术要点

番木瓜(Carica papaya L.)俗称木瓜,别称万寿果,为番木瓜科番木瓜属多年生常绿大型草本植物,为我国南方常见果树。原产墨西哥南部和中美洲地区,17世纪传入我国后,台湾、福建,广东、海南、广西、云南等省区都有栽培。番木瓜用途很广,营养丰富,含有多种维生素,特别是维生素A含量比菠萝高20倍,还含有维生素B、维生素C及丰富的糖分及钙等。番木瓜果实作鲜食外,生果可腌酸菜或作蔬菜煮食用,还可制作果脯、果浆、果汁和罐头,并可提取果胶。番木瓜的所有绿色部分均含有一种番木瓜碱,可供药用,此外,尚含有番木瓜凝乳蛋白酶,这种蛋白酶     

番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因CpCP的分离及表达分析

采用cDNA-AFLP技术分离了一个与番木瓜果实成熟衰老相关的差异片段,经生物信息学分析证实该片段属于半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease,CP）基因。将差异片段序列在NCBI中的番木瓜基因组序列中搜索,获得了半胱氨酸蛋白酶基因DNA序列。设计开放型阅读框上、下游引物,以木瓜果肉RNA逆转录的cDNA为模板扩增该基因全长cDNA序列,命名为CpCP（登录号：JN689334）。该基因属于C1肽酶家族中的C1A亚家族,编码471个氨基酸,含有家族特有的催化三联体：Cys166-His302-Asn322。Real-time PCR结果显示CpCP在果实中大量表达,是根、茎、叶、花中表达量的几十倍;CpCP受乙烯处理诱导,受1-MCP处理抑制,表达模式与番木瓜果实成熟衰老进程一致,说明CpCP参与了番木瓜果实成熟衰老进程。     

龙眼LEAFY同源基因启动子的克隆与序列分析

为了解龙眼LEAFY同源基因（LLFY）的表达调控规律,应用染色体步移方法克隆了809 bp的LLFY启动子序列。用在线软件PlantCARE分析表明,该序列除含有启动子基本元件,如TATA-BOX、CAAT-BOX外,还含有参与生理周期调控、干旱诱导MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件等一些其他的调控序列,推测...     

番木瓜开花相关基因CpFT1及启动子的克隆与表达分析

以番木瓜（Carica papaya L.）花为材料,利用番木瓜基因组序列设计番木瓜CpFT1和启动子扩增引物,通过PCR获得了该基因长度为525 bp的基因组DNA序列和1 500 bp的上游调控序列。通过生物信息学分析,发现CpFT1编码174个氨基酸。经序列对比及进化分析发现,番木瓜FT基因与山毛榉FT基因同源性最高。亚细胞定位显示CpFT1蛋白定位于细胞核。进一步分析CpFT1的启动子序列,脱落酸、赤霉素、水杨酸等激素调控相关的元件位于CpFT1上游1 500 bp的序列上。利用实时荧光定量PCR检测了CpFT1在不同性别花器官、花不同发育阶段以及不同激素处理下花中的表达差异,结果表明CpFT1的表达可能受到脱落酸、水杨酸等激素的调控。     

杧果MiLCYB2基因启动子的克隆与序列分析

【目的】了解杧果Mi LCYB2基因的表达调控规律。【方法】应用染色体步移方法克隆了991 bp的Mi LCYB2基因启动子序列。【结果】用在线软件Plant CARE分析表明,该序列除含有启动子基本元件,如TATA-BOX、CAAT-BOX外,还含有ABA、GA、Auxin、SA、Me JA多种植物激素响应元件,以及参与生理周期调控、MYBHv1结合位点和光响应元件等一些其他的调控序列,推测Mi LCYB2基因的表达受多种植物激素、光照、生理周期、MYBHv1转录因子等的调控。【结论】杧果Mi LCYB2基因启动子的分离与序列分析为进一步探究杧果类胡萝卜素基因的调控机制提供了新的理论基础。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

短枝型苹果赤霉素受体基因MdGID1a 及其启动子克隆和表达分析

 以短枝型富士苹果‘龙富短枝’（Malus × domestica Borkh.‘Longfu Duanzhi’）枝条为试材, 采用RT-PCR 结合RACE 技术,克隆获得苹果赤霉素受体基因MdGID1a,GenBank 基因数据库的登录号 为JF516247。该基因编码区共1 035 bp,推测其编码345 个氨基酸。氨基酸序列分析显示,其具有HSL 基因家族的保守氨基酸结构域HGG 和GXSXG,与其它植物赤霉素受体基因具有较高的同源性。其启动 子序列包含植物激素和光等响应元件。实时定量qRT-PCR 分析表明,MdGID1a 在短枝型‘龙富短枝’和 普通型‘长富2 号’枝条不同生长阶段、在叶片、枝条、果实、花和叶芽中的表达水平存在明显差异。 苹果赤霉素受体基因MdGID1a 在短枝型苹果枝条伸长过程中具有一定的调控作用。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

番木瓜四倍体的诱导及形态学分析

在离体培养条件下,将二倍体穗中红番木瓜无菌试管苗茎尖浸入0.05%、0.1%、0.2%、0.4%秋水仙素水溶液中处理1、2、3、4、5d,诱导多倍体,对照用无菌水处理2d。结果表明0.2%的秋水仙素溶液浸泡处理3d效果最好,诱导率为36.7%。通过体细胞染色体数目检测,变异芽为四倍体或嵌合体,四倍体染色体数目为36(2n=4x=36)。对获得的四倍体和二倍体进行了形态及气孔特征的比较,结果表明四倍体与二倍体植株在叶长、叶宽、叶厚、气孔大小、气孔密度、气孔保卫细胞大小及叶绿体数目等方面存在明显的差异,其中叶片厚度、气孔密度和保卫细胞内叶绿体数目可作为鉴别四倍体与二倍体的重要性状。     

番木瓜的核型分析

 分析比较了‘穗中红’、‘日升’和‘美中红’3个品种的核型, 发现3个品种均具有1对中部或中间随体, 但前两个品种的随体位于第6对染色体上, 而‘美中红’位于第7对染色体上。根据前两个品种中发现存在的异形染色体, 推测番木瓜性染色体的存在。3个品种的核型公式分别表示为: ‘穗中红’2n = 2x = 18 = 16m (2SAT) + 2 sm, ‘日升’2n = 2x = 18 = 14m (2SAT) + 4 sm, ‘美中红’2n = 2x = 18 =16m (2SAT) + 2 sm。3个品种均属于“2A”核型, 但核型有一定的区别。     

番木瓜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与特征分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因产物催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增番木瓜叶片基因组DNA和cDNA。在NCBI中用BlastX比对发现,5个来自基因组DNA的克隆和4个来自叶片cDNA的克隆可能编码的氨基酸残基序列属于STK蛋白激酶类抗病基因同源序列片段和受体样蛋白激酶基因的同源片段,命名为gPK1-gPK5和cPK1-cPK4,在GenBank注册得到序列号分别为AY693385-AY693389,AY738762-AY738765。除克隆gPK5含有内含子之外,其它都发现了连续阅读框ORF。通过分析除Gpk5之外的8个克隆可能编码氨基酸序列中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白激酶的9个催化保守结构域Ⅰ-Ⅸ,并利用ClustalW软件对8个克隆和已报道的抗病蛋白水稻Xa21和西红柿Pto氨基酸残基序列进行分子系统进化树分析发现,8个克隆不仅是受体样蛋白激酶基因的同源片段而且是抗病候选基因片段。     

惠州优质高产番木瓜的栽培技术研究

文章研究和总结在惠州引种优质高产的番木瓜的经验:番木瓜生产过程中选用早结、丰产、优质、抗病毒病强的优良品种是前题,培育壮苗是基础,早结丰产栽培技术是关键;番木瓜1年生栽培方式有利于避开冬季霜冻危害,同时,能最大限度地减轻特别是番木瓜环斑病毒病的发生,降低防治成本.     

番木瓜四倍体与二倍体的核型分析及45S r DNA-FISH研究

 以番木瓜四倍体与二倍体植株为材料, 利用45S rDNA为探针, 结合核型分析与荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization, 简称FISH) 技术, 分析比较了二者之间的核型特征。结果表明: 二倍体与四倍体番木瓜在核型特征上没有明显差异, 染色体绝对长度在2.35～4.76μm之间, 属于中小染色体,均由中部着丝粒染色体(m) 和近中部着丝粒染色体( sm) 组成, 属“2A”类型, 二倍体核型公式为2n=2x=18=16m (2SAT) +2 sm, 四倍体为2n=4x =36=32m (4SAT) + 4 sm; 在二倍体体细胞中期染色体及间期核中, 均发现两个杂交信号位点, 在四倍体中则发现4个杂交信号位点。二者的杂交信号均位于第6对带有随体的同源染色体的次缢痕区域。由此认为该四倍体是由二倍体直接加倍形成的同源四倍体。     

番木瓜果实成熟相关基因的cDNA-AFLP分析及克隆

 为了探讨番木瓜果实成熟机理,利用cDNA-AFLP技术对破色期和半黄期的番木瓜果实进行基因差异表达分析,获得了50个与果实成熟相关的差异基因片段,其中28个与GenBank数据库中的功能基因同源,分别参与了果实成熟过程中基因表达调控,DNA与蛋白质合成及运输,蛋白质降解,能量代谢,营养物质代谢和逆境胁迫反应等过程。在差异片段序列基础上设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术成功克隆了4条差异基因cDNA全长,分别命名为CpGMP、CpPAA1、CpPOD和CpMYB。半定量RT-PCR分析结果表明,随着果实的成熟衰老,4个基因的表达量相应变化,说明其可能参与果实的成熟过程。     

番木瓜叶片精油化学成分的GC-MS分析

采用常压水蒸汽蒸馏法提取得到番木瓜叶片的精油,应用气相色谱-质谱联用技术对其精油的化学成分进行了分析,共分出109个峰,通过对照分离峰的质谱匹配度结合保留指数匹配度鉴定了72种化合物,占挥发油总量的90.5%,主要成分是苯甲腈(57.49%),β-硝基乙醇(12.01%),硫氰酸苯甲基酯(5.35%),3-硝基丙酸(2.43%),1-(1-乙氧基乙氧基)丙烷(2.33%),(S)-2-羟基-丙酸乙酯(1.98%),2,4-二甲基-1,3-二氧杂环乙烷(1.52%),2,4,5-三甲基-1,3二氧戊环(1.4%),香豆满(1.18%),α-妥鲁香烯醇(1.12%),其余化学成分的含量均少于1%。其中腈类化合物占57.72%,醇类占15.84%,酯类占8.89%,烷烃类占5.88%,酮类占3.29%,酸类占2.74%,还有一些呋喃类(主要是香豆满),醛类及萘(主要是二甲基萘)等,它们共同构成番木瓜叶片精油的化学成分。