麻风树JcHDZ28基因克隆与功能分析

HD-Zip家族基因与植物的生长和对环境胁迫的抗性密切相关,被认为是作物改良的关键因子。在本研究中,我们通过RT-PCR技术从麻风树中克隆了1个HD-Zip家族基因,命名为JcHDZ28。JcHDZ28基因包含1个882 bp的开放阅读框,编码1个含有293个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析结果表明,JcHDZ28含有高度保守的同源结构域和亮氨酸拉链(LZ)基序。表达模式分析结果表明,JcHDZ28基因在种子中的相对表达量最高,且盐胁迫下调该基因的表达。亚细胞定位分析结果表明,JcHDZ28基因编码1个核定位蛋白。过表达JcHDZ28基因增加了转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性,且在盐胁迫条件下,转JcHDZ28基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥,相对电导率显著高于野生型拟南芥,非生物胁迫相关基因在转JcHDZ28基因拟南芥中的表达也显著低于在野生型拟南芥中的表达。本研究结果可以为进一步阐明HD-Zip转录因子基因JcHDZ28在麻风树生长发育和响应非生物胁迫中的功能提供理论依据。     

麻风树EST-SSR的筛选和分析

[目的]开发麻风树EST-SSR标记,为遗传多样性分析、种质资源鉴定等研究提供理论依据。[方法]以麻风树EST序列为材料,运用CAP3软件对EST序列进行组装后,再运用SSRIT软件进行EST-SSR标记的预测。[结果]麻风树13193条EST序列经组装后获得6281个UniGene,其中1367个Contig,4914个Singleton。利用SSRIT在线软件对UniGene分析得到206条EST-SSR。拼接后的Unigene含有SSR位点的频率为3.28%,麻风树EST-SSR的发生频率为1/29kb。这些EST重复基元中,三核苷酸重复和二核苷酸重复最多,分别占24.76%和21.84%;五、六核苷酸重复次之,分别占16.50%、20.39%;单、四核苷酸的重复基序最少,分别占9.71%和6.80%。在所有的核苷酸重复基序中,二核苷酸重复序列AG所占比例最高,约占12.62%;三核苷酸重复序列中,所占比例最高的是AAT和AAG,各占6.80%、6.31%。[结论]上述结果对于开展麻风树分子辅助育种研究具有一定的指导意义。     

麻风树菌根育苗方法

本文提出了一种麻风树菌根育苗方法,包括菌根剂准备、种苗处理、菌根剂接种、移栽和接种苗管护步骤。结果表明,该接种菌根菌能提高麻风树的抗逆性、适应性,促进根系生长,提高麻风树种苗移栽成活率,促进生殖生长,增加产量。     

麻疯树JcWRI1基因启动子克隆及功能分析

WRI1基因在控制从碳水化合物到脂类的转化过程中起着重要的作用。通过qRT-PCR方法分析了JcWRI1在麻疯树不同组织中的表达特性,结果表明:JcWRI1主要在种子中表达。同时克隆了麻疯树JcWRI1基因起始密码子上游2 000 bp序列。序列分析表明,该序列不仅包含有TATAbox和CAAT-box基本元件,而且含有胚乳表达所需的顺式调控元件、脱落酸应答相关顺式作用元件、光响应元件及各种胁迫响应元件。将该启动子与GUS报告基因连接构建表达载体,并转化水稻。GUS组织化学染色分析结果表明,JcWRI1启动子驱动GUS基因在根、茎、叶中有很低的表达,然而在种子中具有较高的表达活性。表明该启动子主要在种子中表达,并受多种因子的调控。     

氮磷钾肥料处理对麻风树苗木生长及生理特性的影响

以麻风树实生苗为试材,利用盆栽试验研究了氮、磷、钾配比施肥对麻风树幼苗生长和生理指标的影响。结果表明:与对照相比,不同氮、磷、钾配比施肥都显著提高了麻风树的生长和生理指标;经方差分析,氮肥对麻风树生长和生理影响最显著,磷、钾分别对不同的指标有不同程度的促进作用。模糊综合分析表明,在9种配比施肥处理中,N2P3K1(即N、P、K施入量分别为1.00、1.60、0.15 g/株)处理对麻风树苗期生长和生理指标促进作用最显著。     

麻风树幼苗对锰胁迫的生理响应研究

通过水培实验研究了不同浓度锰胁迫对麻风树幼苗生理生化特性的影响。结果显示:随着锰胁迫浓度的升高,麻风树幼苗叶片中的叶绿素含量和过氧化物酶活性逐渐下降,丙二醛含量和游离脯氨酸含量不断升高,可溶性糖及可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趋势。研究表明,麻风树对重金属锰污染具有有一定的耐受性。     

抑制麻风树溃疡病病原菌的土壤细菌筛选

通过稀释涂布法分离得土壤细菌63株,采用对峙生长法筛选出营养竞争性抑制麻风树溃疡病病原菌的菌株4株,并进行了初步鉴定,抑制菌株均为革兰氏阳性球菌,有英膜,厌氧或兼性厌氧,具有一定的耐盐性。经初步测定,WT2-2-2-a菌株的抑菌率最高,达42.3%。     

麻风树无性系种实性状变异与选择

【目的】分析麻风树单果均质量、百粒质量、出仁率、出籽率、种子体积、种仁含油量和单株果实产量等性状的遗传变异,在此基础上,对无性系进行评选.【方法】对海口市新海林场3年生麻风树无性系试验林33个无性系的种实特征进行调查;通过聚类分析,对参试无性系进行分类,并作综合评定.【结果和结论】麻风树无性系间在种实性状上存在显著差异.18号无性系百粒质量最大,26号和20号种仁含油量最高;百粒质量与单果均质量、种子体积和种仁含油量相关性达到极显著水平,种仁含油量除与出籽率和种子体积相关性不显著外,与其他性状相关性均达到显著水平;经综合评价,初步确定1、30、18、15和25号为优良无性系.     

复合肥施用方式对麻风树幼苗生长及肥料利用效率的影响

以麻风树栽培品种FD-8号为试验材料,采用盆栽方式,研究复合肥3种施用方式(100%作基肥、50%作基肥+50%作追肥、25%作基肥+50%作第1次追肥+25%作第2次追肥)对秋播麻风树幼苗生长及肥料利用效率的影响。结果表明:施用复合肥能加快麻风树幼苗出土,促进幼苗生长,提高苗木氮、磷、钾含量和积累量;随施肥次数的增加,麻风树苗木根系生长量明显增加,苗木地径、茎高、干物质积累量、苗木质量指数及植株氮、磷、钾积累量、肥料氮、磷、钾养分利用率均先增加后降低。其中复合肥(N∶P2O5∶K2O=28∶6∶6)以50%作基肥+50%作追肥的综合效应较好,复合肥全部作基肥施用则有利于简化施肥作业。     

舞毒蛾LdGSTe1基因的克隆及表达

从舞毒蛾(Lymantria dispar)3龄幼虫转录组文库中鉴定获得舞毒蛾谷胱甘肽S–转移酶基因全长c DNA,命名为Ld GSTe1。该基因全长651 bp,编码216个氨基酸。序列分析显示,Ld GSTe1蛋白氨基酸序列含有GST_C_Delta_Epsilon与GST_N_Delta_Epsilon 2个保守结构域,属于类硫氧还蛋白和谷胱甘肽S–转移酶2个超家族。系统进化树分析表明,舞毒蛾Ld GST蛋白属于GST Epsilon家族。蛋白结构显示,Ld GSTe1蛋白包含一个N端和一个C端结构,α–螺旋与β–折叠为主要结构元件。实时荧光定量PCR结果表明,在4.0、10.0 mg/L鱼藤酮药剂处理下,舞毒蛾3龄幼虫Ld GSTe1基因表达先下降后上升,推测该基因参与舞毒蛾解毒应答。     

小麦avenin-like type-B基因启动子的克隆及功能验证

为深入研究ALPtype-B基因的调控机理及胚胎特异性表达特性,采用农杆菌转化技术,将含有ALPtype-B基因启动子的双元表达载体转化烟草。对阳性转基因烟草植株进行GUS组织化学检测定性分析。结果显示,小麦ALPtype-B基因启动子可驱动报告基因在烟草种子的胚乳中特异表达,在其他组织中没有表达。     

黑杨GASA基因的克隆和功能分析

为研究黑杨的速生分子调控机制,采用PCR技术,从欧美杂种黑杨R270(Populus deltoides×Populus nigra)中克隆得到GASA基因,并构建其植物表达载体,通过农杆菌花序侵染法转入拟南芥,获得转基因植株,进行黑杨GASA基因的功能分析。结果表明:克隆得到的黑杨GASA基因cDNA片段总长为330 bp,可编码109个氨基酸残基;与野生型拟南芥相比,超量表达PdGASA4能促进拟南芥的提早抽薹、叶片的伸长及茎的增高和加粗。     

澳洲坚果MYB1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从澳洲坚果(Macadamia integrifolia)叶片中克隆MYB1转录因子基因(MiMYB1)并进行生物信息学分析,为揭示R2R3-MYB家族转录因子成员在澳洲坚果中的抗逆作用机制提供参考依据.[方法]利用PCR从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆MiMYB1基因,采用ProtParam、TMHMM Server v.2.0和SMART:Main page等在线分析软件对MiMYB1蛋白进行生物信息学分析,运用DNAMAN 7.0进行蛋白氨基酸多序列比对分析,并从NCBI中选取126个拟南芥R2R3-MYB家族成员,以Geneious Pro v4.8.4中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树.[结果]从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆获得的MiMYB1基因序列全长1205 bp,包含1062 bp的开放阅读框(ORF),共编码353个氨基酸,GenBank登录号为MN254975.MiMYB1蛋白具有2个SANT保守结构域,属于R2R3-MYB家族,是无跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水性蛋白.MiMYB1氨基酸序列(MN254975)与荷花NnMYB39氨基酸序列(XP_010277911.1)的亲缘关系最近,相似性为71.81%;与哥伦比亚锦葵HuMYB102-like(XP_021293847.1)、榴莲DzMYB102-like(XP_022777375.1)、木薯MeMYB102-like(XP_021596793.1)和高山栎QsMYB102-like(XP_023877052.1)的MYB氨基酸序列相似性分别为67.47%、68.63%、64.44%和67.28%.MiMYB1蛋白与126个拟南芥R2R3-MYB家族成员的系统发育进化分析结果显示,MiMYB1与AtMYB41的亲缘关系最近,与AtMYB41、AtMYB74和AtMYB102同属于S11亚族,具有相似的生物学功能,即与植物抗逆性功能相关.[结论]MiMYB1是典型的植物R2R3-MYB转录因子,在澳洲坚果的抗逆反应中发挥作用.     

木毒蛾氨肽酶N1基因克隆与表达分析

[目的]氨肽酶N(APN)是昆虫中肠一类重要的Bt受体蛋白,Bt细菌产生的Cry毒素对昆虫的毒杀作用机理在学术界存在一定争议,但是普遍认为毒素与Bt受体蛋白的结合是产生毒力的必要环节.本研究通过基因克隆、生物信息学分析以及不同龄期组织中的表达对木毒蛾APN1基因进行研究,为后续研究APN基因家族、其他Bt受体蛋白及Cr...     

巴西橡胶树FCA基因的克隆及功能分析

FCA基因是植物自主开花途径中的重要调控基因,已被证实是促进植物开花的保守基因。研究通过巴西橡胶树甲基化文库获得橡胶树HbFCA基因一段434bp的保守cDNA 序列,应用RACE技术,成功克隆得到橡胶树的HbFCA基因。进一步通过构建HbFCA真核过表达载体pXCS-HbFCA-HAStrep,并转化拟南芥发现,转基因植株35d后已经抽薹开花,野生型对照未开花,HbFCA的过表达能显著促进拟南芥开花。     

文冠果LEC1基因的克隆及表达分析

目的文冠果隶属无患子科, 是我国北方重要的油料树种, 种子含油量高, 是制备食用油、生物柴油等的优质原料。本研究旨在克隆文冠果Leafy Cotyledon 1(XsLEC1)基因, 进行序列及表达模式的分析。方法以文冠果种胚为试材, 利用RT-PCR和RACE技术克隆文冠果LEC1基因。采用Protparam及TMHMM2.0软件预测XsLEC1蛋白的理化性质和跨膜结构域, ProtComp9.0及Motif Scan软件预测XsLEC1蛋白的亚细胞定位及蛋白功能, BioEdit及MEGA7软件分析XsLEC1蛋白的多重序列比对和进化关系。运用RT-PCR和实时荧光定量PCR分析XsLEC1基因的表达模式。结果XsLEC1 cDNA全长1 035 bp, 包含一个长度为690 bp的开放阅读框(GenBank号为MF616360), 可编码229个氨基酸。推导的氨基酸序列包含一个HAP3亚基的保守功能域B。该保守功能域内含有组蛋白折叠中的3个α螺旋(α1、α2、α3)和两个短环结构(L1、L2)。在线预测该蛋白为稳定的, 亲水性蛋白, 无信号肽和跨膜区域, 定位于细胞核, 存在多个磷酸化位点。二级结构主要由α螺旋和无规则卷组成。进化分析表明, 该蛋白序列与同科龙眼亲缘关系最近, 其次为麻风树和毛果杨。RT-PCR实验得出, XsLEC1基因在文冠果的根、茎、叶及花中均无表达, 在种子中出现较高表达。实时荧光定量PCR结果进一步显示, XsLEC1基因在种胚中有明显的时序表达特性, 在种胚发育的前期(花后33、40、47 d)表达较高, 在种胚发育的后期(花后54、61、68 d)表达较低, 至花后75 d时仅有微量表达, 而在完全成熟的种胚(花后81 d)中未检测到XsLEC1的表达。结论文冠果LEC1基因的克隆及表达分析, 为以后深入研究XsLEC1的功能奠定了分子基础, 同时对生产实践中文冠果油脂品质的改良有一定的实践意义。      

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA的克隆与序列分析

通过RT–PCR方法克隆了甘蓝型油菜湘油15号5个WRI1基因cDNA。测序结果显示,BnWRI1–1大小为1 248 bp,BnWRI1–2和BnWRI1–3大小为1 254 bp,BnWRI1–4、BnWRI1–5大小为1 242 bp;聚类分析结果显示,所克隆WRI1基因cDNA在进化关系上属于AP2/ERF转录因子家族,同拟南芥AtWRI1(At3G54320)同处1个分支,并且所克隆基因cDNA来自甘蓝型油菜不同的基因组;通过核苷酸序列比对分析,得到所克隆WRI1基因cDNA单核苷酸变异位点40个;特异性酶切位点分析显示,来源于A基因组的BnWRI1–1、BnWRI1–2、BnWRI1–3第892位与来源于C基因组的BnWRI1–4和 BnWRI1–5第880位的核苷酸发生变异,导致Bcl I识别位点的变化;酶切试验结果表明,采用BclI酶可区分甘蓝型油菜的AtWRI1–like WRI1 基因的A或C 基因组来源。     

南美蟛蜞菊WtActin1基因克隆及表达稳定性分析

[目的]克隆南美蟛蜞菊肌动蛋白基因(WtActin1),并进行生物信息学及表达稳定性分析,为南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因表达及调控研究提供可靠的内参基因.[方法]RACE克隆WtActin1基因,通过在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR检测该基因在不同组织及温度胁迫下的表达情况.[结果]克隆获得的WtActin1基因cDNA全长1682 bp(GenBank登录号MN485900),其中5'非编码区(5'-UTR)170 bp,3'非编码区(3'-UTR)378 bp,开放阅读框(ORF)1134 bp,编码377个氨基酸残基.WtActin1蛋白分子量为41725.81 Da,理论等电点(pI)为5.31,不稳定性指数(II)为37.48,亲水性的平均值(GRAVY)为-0.166,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和无信号肽,主要存在于细胞质中,具有Actin蛋白家族的典型特征结构,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,三级结构同源模型为嵌合肌动(3ci5.1.A),与莴苣、橡胶草和洋蓟的同源蛋白三级结构高度相似.WtActin1基因与其他植物Actin基因核苷酸序列相似性在86.4%以上,其推导氨基酸序列相似性在94.0%以上.从基于Actin氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树可看出,WtActin1与同为菊科的莴苣LsActin7亲缘关系最近,与传统分类学相吻合,其次是菊科的橡胶草TkActin1和锦葵科的棉花GhActin.WtActin1基因在南美蟛蜞菊根、茎、叶和花中的表达量均无显著差异(P>0.05,下同),且在高、低温胁迫下与正常温度处理的表达量也均无显著差异.[结论]WtAtin1基因属于Actin基因家族成员,在不同组织及温度胁迫下均能稳定表达,可作为内参基因用于南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因研究.     

柑橘LEAFY同源基因片段的克隆及分析

在提取大三岛脐橙(Citrus sinensis(L)Osbeck)基因组DNA的基础上，利用Uneven PCR的方法克隆了脐橙中的LEAFY(LFY)同源基因片段。经对该基因片段的核苷酸序列分析表明，它和烟草中的LFY同源基因NFY基因在结构上高度保守，同源性高达90%以上。